NF-κB信号通路在炎症状态下人牙周膜干细胞成骨分化中的调控作用

摘要

牙周病是造成成年人缺牙的首要原因,发病率高达90％。其发病机制是由于细菌聚集于牙表面或侵入牙周组织,通过直接侵袭及引发机体慢性炎症反应,引起牙周软组织连接的破坏及牙槽骨的吸收,造成牙支持结构的丧失,最终导致牙松动脱落。目前尚没有有效根治牙周病的手段和方法。
　　正常情况下,牙周组织具备良好的再生能力,牙槽骨与牙周膜始终处于动态改建过程中,维持着牙周支持结构的完整性。牙周膜中有一群多潜能成体干细胞,表达间充质干细胞的表面标志物,具备自我更新及多向分化能力,体外诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织,并能在体内移植后形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨样结构物,被认为在牙周改建、再生、修复过程中发挥了重要作用。已有研究发现牙周局部炎症微环境可以通过抑制 PDLSCs的再生能力导致牙周组织的破坏,但其具体机制尚不清楚。
　　NF-κB是免疫转录过程中的关键核转录因子。各种急性及慢性炎症均能导致NF-κB信号通路活化,并通过转录激活下游免疫相关基因而发挥重要作用。同时,NF-κB信号通路通过调控 RANKL/RANK表达、调节成骨分化信号通路及骨基质形成,而对骨发育和骨改建过程发挥关键调控作用。但以往研究大多关注于炎症因子活化NF-κB信号通路对破骨细胞形成及活化的作用,对于其是否参与了牙周病慢性炎症的发生发展过程,是否导致了牙周病骨形成缺陷,是否对 PDLSCs的成骨分化具有抑制作用,及其具体的信号调控途径及机制尚不明确。因此,本实验利用从健康人群和牙周病患者牙周组织中分离纯化的牙周膜干细胞,比较NF-κB信号通路在不同来源干细胞中的表达差异,研究其在炎症条件下对 PDLSCs成骨分化的作用机制,从而加深对牙周病发病机制的了解,并为寻找特异性的治疗靶点、探索基于干细胞的再生手段提供新的思路。
　　研究目的:
　　1)探讨牙周组织局部慢性炎症微环境对人牙周膜干细胞(human periodontal periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)生物学特性的影响。
　　2)探讨炎症微环境对hPDLSCs内NF-κB信号通路的影响,及NF-κB信号通路对人牙周膜干细胞成骨分化的调控作用。
　　3)探讨炎症微环境是否通过NF-κB通路抑制了hPDLSCs的成骨分化;调控 NF-κB通路中关键分子能否逆转炎症微环境对于牙周膜干细胞成骨分化的抑制。
　　研究方法:
　　1)利用组织消化、有限稀释法获取正常和慢性牙周炎症来源的hPDLSCs,免疫细胞化学技术和流式细胞术检测两种细胞表面间充质干细胞标志分子的表达,MTT、克隆形成实验及细胞周期检测比较两种干细胞的增殖能力,成骨和成脂分化诱导检测两种干细胞的多向分化能力。
　　2)利用Western Blot检测p65、IκBα和p-IκBα在不同来源牙周膜干细胞及其成骨分化过程中的表达差异。通过利用BAY11-7082抑制NF-κB通路后茜素红染色、成骨关键基因和蛋白的检测比较 NF-κB信号通路在hPDLSCs成骨过程中的调控作用。
　　3)利用TNF-α(10ng/mL)模拟牙周炎症微环境,激活NF-κB信号通路,进行获得性功能验证;利用BAY11-7082抑制NF-κB信号通路,进行缺失性功能研究。
　　实验结果:
　　1)分离培养的两种牙周膜干细胞均表现为间充质细胞特性。体外有限稀释法单细胞培养均出现细胞克隆,表现出自我更新能力;炎症组的克隆形成率高于正常组;MTT和细胞周期均显示炎症来源干细胞的增值能力明显高于对照组;成骨、成脂诱导后实验结果表明炎症来源的牙周膜干细胞的分化能力不如正常牙周膜干细胞。
　　2)炎症组织来源的牙周膜干细胞成骨分化过程中,IκBα磷酸化上调表达较正常组织来源细胞明显,核内p65表达也增高。而在加入BAY11-7082后,能部分恢复炎症组织来源的牙周膜干细胞的成骨能力。
　　3)炎症因子 TNF-α刺激正常组织来源的牙周膜干细胞后,NF-κB信号通路明显激活,成骨相关基因和蛋白表达明显下调,说明hPDLSCs的成骨能力收到了抑制。在TNF-α刺激的同时加入BAY11-7082后,成骨相关基因和蛋白的表达上调,说明抑制 NF-κB通路能部分恢复 TNF-α所致的牙周膜干细胞的成骨分化能力的降低。
　　结论:
　　1.牙周慢性炎症环境影响了牙周膜内干细胞的生物学特性。
　　2.炎症牙周膜干细胞中 NF-κB信号通路的活化抑制了 P-PDLSCs的成骨分化能力,BAY11-7082阻断NF-κB信号通路后,能部分恢复其成骨能力。
　　3.炎症因子TNF-α能明显激活NF-κB信号通路,并负向调控牙周膜干细胞的成骨分化。抑制NF-κB能有效的逆转TNF-α引起的成骨分化能力的下降。

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封面

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中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 牙周病及其治疗现状

二 TNF-α与牙周病

三 牙周组织工程学和牙周膜干细胞

四 NF-κB信号通路

正文

第一部分 炎症组织来源的hPDLSCs生物学特性研究

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 NF-κB通路调控炎症状态下hPDLSCs成骨能力下降的机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢