自噬在维持急性冷暴露大鼠肝脏能量代谢中的作用

摘要

背景：
　　冷暴露是常见的特殊环境暴露因素。以往的研究发现，-15℃急性冷暴露0.5h可以引起大鼠肝脏能量水平的改变及相关细胞通路活性的变化，复方制剂可以显著缓解急性冷暴露大鼠体温下降，但其机制仍不清楚。自噬是细胞正常生理过程，可以清除损伤细胞器，提供能量代谢底物并抑制凋亡发生；能量应激情况下，自噬可以维持细胞ATP水平。设想急性冷暴露能否引起肝脏细胞自噬水平改变及其产生的影响，复方制剂能否影响急性冷暴露大鼠肝脏能量水平及自噬是否参与复方制剂提高大鼠耐寒能力的过程值得探讨。
　　目的：
　　通过建立大鼠急性冷暴露模型，观察急性冷暴露对大鼠肝细胞能量水平及细胞凋亡的影响，探讨自噬水平变化产生的影响及调控机制，并进一步探讨自噬在复方制剂调控急性冷暴露条件下大鼠肝细胞能量水平及细胞凋亡中的作用及机制。为阐明急性冷暴露对机体造成的损伤、急性冷暴露过程中机体能量的调控及复方制剂提高耐寒能力的作用机制提供理论依据，为冷暴露条件下的机体防护措施提供理论基础。
　　方法：
　　1.急性冷暴露模型的建立：雄性SD大鼠230g±10 g体重，独立暴露于-15℃低温试验舱，暴露时间为4 h。
　　2.肝脏糖原含量测定：用肝糖原检测试剂盒测定大鼠肝组织肝糖原水平。
　　3.肝脏细胞能量水平测定：用ATP检测试剂盒，通过多功能酶标仪进行发光度测定并得到大鼠肝细胞ATP含量值。
　　4.凋亡水平检测：用western blot方法测定肝细胞凋亡相关蛋白caspase-3活化水平及TUNEL染色法观察TUNEL阳性细胞。
　　5.自噬水平检测：用western blot方法测定肝细胞自噬标志物LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达变化；用免疫组化方法，通过MDC染色方法进行肝细胞自噬水平的检测。
　　6.自噬抑制剂对机体的影响：采用腹腔注射的方法，降低自噬水平，同时观察其对肝组织冷暴露应激状态下能量代谢可能产生的影响。
　　7.复方制剂对机体的影响：采用连续灌胃方法，持续灌胃3天。观察能量及自噬水平的变化。
　　结果：
　　1.急性冷暴露对大鼠肝细胞凋亡水平的影响
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝细胞凋亡增加。急性冷暴露组大鼠肝细胞 caspase-3剪切水平显著增加，TUNEL阳性细胞数显著增加（p＜0.05）。
　　2.急性冷暴露对大鼠肝脏ATP及肝糖原水平的影响
　　-15℃急性冷暴露4 h引起大鼠肝脏细胞ATP、肝糖原水平显著下降。室温对照组大鼠肝糖原5.03±0.86 mg/g，而冷暴露对照组大鼠肝糖原降至2.24±1.03 mg/g；对照组大鼠ATP水平为0.293±0.018μmol/mg，冷暴露4 h组大鼠ATP水平降低至0.195±0.044μmol/mg。两者均具有统计学意义（p＜0.05）。
　　3.急性冷暴露对肝脏自噬水平的影响
　　MDC染色检测发现，-15℃急性冷暴露4小时引起肝细胞自噬泡数量增加，与对照组相比具有统计学意义（p＜0.05）；WB检测发现LC3-II灰度水平在急性冷暴露后显著升高（p＜0.05）。提示急性冷暴露引起大鼠肝脏自噬水平显著增加。
　　4.自噬抑制剂对急性冷暴露大鼠肝脏细胞凋亡水平、能量水平及自噬水平的影响
　　腹腔注射自噬抑制剂渥曼霉素可以显著降低肝细胞自噬水平（p＜0.05），渥曼霉素引起急性冷暴露大鼠肝细胞凋亡水平显著升高，进一步增加caspase-3蛋白的剪切及TUNEL染色阳性细胞数量（p＜0.05），并引起肝细胞 ATP含量显著降低，冷暴露抑制剂组大鼠ATP水平为0.146±0.018μmol/mg与冷暴露对照组大鼠ATP水平0.193±0.047μmol/mg相比具有统计学意义（p＜0.05）。而冷暴露抑制剂组大鼠肝糖原水平与冷暴露对照组大鼠相比无明显差异。
　　5.复方制剂对急性冷暴露大鼠肝细胞凋亡水平、肝脏能量水平及肝细胞自噬水平的影响
　　复方制剂灌胃3天可以显著降低急性冷暴露大鼠肝细胞凋亡水平（p＜0.05），并提高急性冷暴露大鼠的肝脏细胞 ATP及肝糖原水平，并同时降低肝组织的自噬水平。冷暴露复方制剂组的大鼠ATP水平为0.236±0.018μmol/mg，与冷暴露对照组大鼠ATP水平0.187±0.030μmol/mg相比具有统计学意义（p＜0.05），冷暴露复方制剂组大鼠肝糖原2.20±1.24 mg/g，而冷暴露对照组大鼠肝糖原降至1.38±0.97 mg/g，相比具有统计学意义（p＜0.05）。
　　结论：
　　1.急性冷暴露可以引起大鼠肝细胞凋亡，肝细胞能量水平降低，并引起细胞自噬水平增加。
　　2.寒冷诱导的自噬有助于维持一定的ATP和代谢水平并抑制凋亡的发生。
　　3.复方制剂可以部分逆转急性冷暴露诱导增加的自噬水平，同时减少细胞凋亡水平并提高急性冷暴露大鼠肝细胞ATP水平以及肝糖原水平。提示复方制剂能够在一定程度上减轻急性冷暴露对肝脏造成的损伤。

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声明

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、冷暴露对机体的影响

二、冷暴露对肝脏的影响

三、自噬与细胞代谢

四、自噬与细胞死亡

五、冷暴露损伤与预防

正文

实验一 急性冷暴露对大鼠肝脏能量代谢及自噬的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 自噬水平的降低对急性冷应激大鼠肝脏能量代谢的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 复方制剂对急性冷暴露大鼠肝脏能量水平以及自噬水平的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢