雌激素相关受体α对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用研究

摘要

雌激素相关受体α(estrogen related receptorα,ERRα)是最早被鉴定出来的孤儿核受体,虽然未被发现内源性配体,但它能通过募集辅调节因子,以组成性方式活化,调节基因转录,在细胞能量代谢和生理功能中发挥重要作用,从而参与一些常见疾病的病理过程,例如癌症、肥胖症、糖尿病等。ERRα还在成骨细胞分化的调节中发挥重要作用,因而成为治疗骨质疏松症的潜在靶点。然而,ERRα在骨代谢方面的现有研究结果尚存在不一致和未阐明之处。
　　牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是一种口腔临床中易于获得的间充质来源的成体干细胞。它具有多向分化潜能和自我更新能力。其成骨分化能力为牙周组织再生提供了新的手段。然而,PDLSCs成骨分化的调控机制尚未研究透彻。ERRα是否参与调控PDLSCs成骨分化尚不清楚。针对以上问题,本课题进行了如下研究:
　　1. PDLSCs的培养鉴定及ERRα在PDLSCs中的表达
　　目的:获取原代PDLSCs,检测ERRα在PDLSCs中的表达。方法:(1)取青少年因正畸治疗需要而拔除的前磨牙,刮取根中1/3牙周膜组织,用组织块结合酶消化法进行牙周膜原代细胞培养。采用有限稀释法进行克隆纯化并检测克隆形成率,CCK-8法检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测干细胞表面标志;(3)成骨、成脂诱导,并分别进行茜素红S和油红O染色检测PDLSCs分化能力;(4)RT-PCR检测PDLSCs中ERRαmRNA的表达;(5)免疫细胞化学和免疫荧光染色检测ERRα蛋白在细胞中的表达定位。结果:(1)原代培养并进行克隆纯化的PDLSCs呈成纤维细胞样形态,具有克隆形成能力和干细胞的增殖特点;(2)PDLSCs具有间充质干细胞的表面标志特征,并具有成骨和成脂分化能力;(3)PDLSCs表达ERRαmRNA和蛋白,其蛋白在细胞核和细胞质中均有广泛表达,主要高表达于细胞核。结论:成功培养并鉴定了具有间充质干细胞特征的PDLSCs,ERRα在该细胞中有广泛表达。
　　2.慢病毒介导的ERRα基因沉默对PDLSCs成骨分化的调控作用
　　目的:研究ERRα基因的下调对PDLSCs成骨分化的作用。方法:(1)设计针对ERRα基因的miRNA寡核苷酸序列四对,通过重组克隆的方法将其插入表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建四个miRNA表达质粒,瞬时转染模型细胞,通过实时定量PCR和Western blot检测ERRα mRNA和蛋白的表达,验证干扰效率;(2)以筛选出的干扰效果最佳片段为模板构建慢病毒质粒pLenti-miR-ERRα,进行慢病毒包装和纯化,感染PDLSCs,构建稳转株,CCK-8检测细胞活性,并使用实时定量PCR和Western blot检测PDLSCs中ERRαmRNA和蛋白的表达;(3)病毒感染的PDLSCs成骨诱导分化后,通过ALP染色、茜素红S染色和实时定量PCR检测成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2和OPN的mRNA表达,比较Lenti-miR-ERRα组与Lenti-miR-neg对照组PDLSCs成骨分化能力的差异。结果:(1)成功构建4个miRNA表达质粒,均能下调ERRαmRNA和蛋白的表达,其中pcDNA6.2-miR-ERRα-4干扰效果最佳,对其进行克隆重组、慢病毒包装和病毒液纯化;(2)成功构建Lenti-miR-ERRα稳转株, ERRα的mRNA和蛋白水平受到稳定的基因干扰,CCK-8结果显示Lenti-miR-ERRα组PDLSCs细胞活力与转染对照组和空白对照组相比略有降低;(3)Lenti-miR-ERRα组PDLSCs的ALP活性、矿化能力以及成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2和OPN mRNA表达水平较转染对照组显著下降。结论:(1)慢病毒miRNA载体能稳定下调ERRα在PDLSCs中的表达;(2)ERRα的下调降低了PDLSCs成骨分化能力,提示ERRα可能对PDLSCs成骨分化有促进作用。
　　3. ERRα在PGC-1α的辅助激活下对PDLSCs成骨分化的调控作用
　　目的:研究ERRα在辅激活因子PGC-1α的激活下,对PDLSCs成骨分化的影响。方法:(1)ERRα反向激动剂XCT790作用于PDLSCs,成骨诱导后进行ALP活性检测、ALP和茜素红S染色。(2)构建ERRα和PGC-1α的表达载体,优化电穿孔转染PDLSCs条件,将两载体分别单独或共转染PDLSCs,实时定量PCR和Western blot验证转染效果;(3)将PDLSCs分组为:ERRα、PGC-1α、ERRα+PGC-1α组、空转染组和空转染+XCT790作用组;成骨培养7 d后,测定细胞内Ca2+浓度,实时定量PCR检测成骨相关基因ALP、OCN、OPN、RUNX2和COL1A1的mRNA表达情况。结果:(1)XCT790显著降低PDLSCs ERRα和PGC-1α蛋白表达,并在成骨分化2周内强烈抑制ALP活性,最终降低矿化PDLSCs矿化能力;(2)成功构建ERRα和PGC-1α表达载体并分别单独或联合电穿孔转染PDLSCs,实时定量PCR和Western blot验证了mRNA和蛋白的过表达水平;(3)PDLSCs成骨诱导7 d,ERRα过表达上调ALP、下调RUNX2和OPN的mRNA表达,PGC-1α过表达显著上调ALP、COL1A1和RUNX2而下调OPN mRNA的表达,ERRα+PGC-1α过表达显著上调ALP、COL1A1和RUNX2的mRNA表达,而对OCN、OPN的mRNA表达无显著影响;(4)XCT790不改变ERRα的mRNA表达水平,而通过下调ERRα蛋白和PGC-1α的mRNA与蛋白水平,显著降低ALP、COL1A1、OCN和RUNX2的mRNA表达,显著上调OPN mRNA表达和细胞内Ca2+浓度。结论:ERRα在PGC-1α的辅助激活下,能够通过提高ALP、COL1A1和RUNX2的表达水平而促进PDLSCs成骨分化。

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前言

文献回顾

一 雌激素相关受体α概述

二 雌激素相关受体与成骨分化

三 牙周膜干细胞与雌激素通路介导的牙周组织改建

正文

实验一 PDLSCs的培养鉴定及ERRα在PDLSCs中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 慢病毒转染miRNA-ERRα对PDLSCs成骨分化的调控作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 ERRα在PGC-1α的激活下对PDLSCs成骨分化的调控作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢