贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构的构建及其在经皮种植体表面处理中的应用

摘要

【背景】:
　　在颌面赝复体如义耳、义眼等的修复过程中,经皮种植体的使用可以显著改善赝复体的支持、固位和稳定[1]。该类种植体在植入骨组织之前需要穿过较厚的皮肤组织层,如果无法实现种植体经皮段-皮肤软组织界面的紧密结合,将易受机械应力的牵拉分离,导致细菌入侵及上皮下行,引发种植体周围炎,从而影响经皮种植体的长期存留率。
　　为了达到种植体经皮段与皮肤软组织形成牢固的生物学封闭,不但要优化种植体的外形设计,尽量减小其对不良机械应力的影响,更需要将种植体表面进行改性处理,设法促进皮肤在材料表面的生长。在皮肤与种植体结合过程中,发挥主要功能的细胞是成纤维细胞,其能分泌糖胺聚糖以及I型胶原等结缔组织的重要成分。成纤维细胞的增殖以及基质的分泌有利于牢固的经皮封闭形成,从而阻挡细菌入侵及上皮下行。
　　从紫贻贝(Mytilusedulis)提取的贻贝足丝蛋白能够在水环境中粘附到多种基体上,该蛋白具有良好的生物相容性,且无种属特异性。商品化贻贝蛋白试剂BDCELL-TAKTM已成功用于细胞培养、免疫组化、原位杂交技术等方面。贻贝蛋白本身依靠自身优良的湿润粘接性能可以方便地与任意形状的种植体表面牢固结合,实现涂覆;作为一种粘接介质,在种植体植入同期便可以实现材料与皮肤组织间一定的密合;而且贻贝蛋白显著地改善了材料表面性能,其中最显著的作用是促进细胞在材料表面的粘附。
　　碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)作为重要的细胞分裂原,可以有效促进成纤维细胞和骨细胞等的增殖。但是由于bFGF易被蛋白酶分解,因此必须研究一种既能让bFGF稳定不被降解,又能使bFGF持久缓慢释放的载体,保证其在体内长时间与靶细胞受体结合,在一定时间内持续发挥作用。本研究采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)作为bFGF载体材料,应用W/O/W溶剂萃取-挥发法制备出碱性成纤维生长因子-聚乳酸羟基乙酸共聚物微球(bFGF-PLGAMS)。以往研究证明PLGA微球在水溶液中携带负电荷,而贻贝蛋白恰好携带大量重复的携带正电荷的的多巴胺功能集团,依靠两者之间的静电吸引作用,PLGA微球在溶液中可以自发地吸附并固定于贻贝蛋白表面,从而在种植体表面构建出贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构。bFGF-PLGA微球可以在相对较长的时间内保持bFGF的药理活性,且能持续缓慢的释放生长因子,发挥促进成纤维细胞增殖以及基质分泌的作用。
　　【目的】:
　　在研究单纯贻贝蛋白(Usun-afix和BDCELL-TAKTM)包被钛片的各项物理和生物学功能功能以及制作bFGF-PLGA微球的基础上,重点研究贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛片对成纤维细胞早期粘附、增殖、细胞骨架伸展和与基质分泌相关基因表达的影响,通过SD大鼠皮下移植实验研究该复合结构包被钛片与软组织结合的效果,研究该复合结构是否促进了成纤维细胞的增殖以及基质的分泌,从而有利于种植体经皮段生物学封闭的形成,提高种植体存留率。
　　【方法】:
　　本研究采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA作为bFGF载体材料,应用W/O/W溶剂萃取-挥发法制备出碱性成纤维生长因子-聚乳酸羟基乙酸共聚物微球。用手动涂覆法在光滑钛表面进行两种贻贝蛋白(Usun-afix和BDCELL-TAKTM)涂布,制作贻贝蛋白包被钛片;配置一定浓度的bFGF-PLGA微球水溶液,在静电引力作用下使其自动吸附至蛋白涂层表面,构建贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛片。
　　利用扫描电子显微镜观察光滑钛表面、单纯贻贝蛋白涂层以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛表面的微观形态、微球粒径等物理特性。利用X射线光电子能谱分析测定三种样本表面的元素组成;利用接触角仪测定三种样本表面接触角,分析不同样本表面张力大小。
　　小儿包皮真皮成纤维细胞分离、培养,选取3-6代细胞进行实验。检测光滑钛表面、单纯贻贝蛋白涂层以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛表面对成纤维细胞各项生理功能的影响:采用CCK-8法检测成纤维细胞在不同样本表面的增殖能力;DAPI染色荧光显微镜下计数法检测细胞的早期粘附;细胞骨架肌动蛋白免疫荧光染色法观察细胞骨架结构和细胞形态变化;real-timePCR法分析3、6d时与基质分泌相关的基因的表达情况。
　　对光滑钛表面进行贻贝蛋白包被以及在钛表面构建贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构,然后植入SD大鼠皮下。4周后取出,研究各组钛片样本与皮肤软组织的结合情况及炎症反应情况;剥离钛片表面软组织固定后,石蜡包埋切片进行HE染色,观察组织学形态,评估软组织和钛片的结合情况。
　　【结果】:
　　1.单纯贻贝蛋白包被钛片制备以及其对人成纤维细胞生物学功能的影响
　　(1)在纯钛标本表面成功包被不同浓度贻贝蛋白,扫描电镜下观察以约90ug/cm2蛋白浓度包被后,钛表面完全被蛋白覆盖,蛋白膜连续、致密,蛋白颗粒均匀分布。
　　(2)从X射线能量色散谱(EDS)可以看出:光滑钛片表面主要为Ti、O元素分布,经两种贻贝蛋白包被后的钛片表面Ti、O元素含量减小,N、C元素含量增加。
　　(3)在5天的孵育时间内,成纤维细胞在光滑钛片、Usun-afix和BDCELL-TAKTM包被钛片表面增殖情况类似,三者之间无统计学差异(P>0.05)。
　　(4)成纤维细胞接种后在15min、30min、1h、2h各时间点,Usun-afix和BDCELL-TAKTM包被钛片表面粘附的细胞数目均明显多于光滑钛片表面;在1h、2h、4h各时间点,通过DiI-AcLDL后染色荧光显微镜观察可发现:Usun-afix和BDCELL-TAKTM包被钛表面的成纤维细胞形态、细胞伸展面积均好于光滑钛片表面。
　　2.贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构的构建及物理特性分析
　　(1)应用W/O/W溶剂萃取-挥发法制备的微球形貌圆整,球面光滑无突起,微球整体分散度好,微球间相互独立无粘连,大小较均匀,粒径主要分布在1.848±0.304μm范围内。
　　(2)利用BCA法绘制标准蛋白曲线,得到标准曲线方程:y=0.0942x+0.829,相关系数为R=0.9852,线性相关性较好。根据包封率、载药量的计算公式,本实验制得的微球包封率为82.60％,载药量为0.12%。
　　(3)本实验制作的bFGF-PLGA微球在1、2、3天时的生长因子释放量为18.5%,32.4%和41.5%,存在一定的突释现象,以第三天为拐点,后期生长因子的释放趋于平缓;第10天时生长因子的释放量达到66.7%,20天释放量接近87%。
　　(4)扫描电镜结果显示:贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球包被钛片表面在均匀粘附一层贻贝蛋白的基础上,上层又较均匀地吸附了一层大小较为均匀的微球,呈现贻贝蛋白和bFGF-PLGA微球的双层复合结构。
　　(5)XPS元素分析表明:贻贝蛋白包被钛片以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球包被钛片均表现出Ti,O元素含量的降低,以及C、N元素含量的增加。
　　(6)接触角检测结果显示:蒸馏水在光滑钛片(Ti)的接触角为83.2°;贻贝蛋白包被钛片以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛片,均表现出较高的亲水性,接触角为分别降至47.5°(P<0.05),68.7°(P<0.05)。
　　3.贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛片对人成纤维细胞生物学功能的影响。
　　(1)在5天的培养时间内,成纤维细胞在贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球包被钛片表面增殖效果显著高于光滑钛片和单纯贻贝蛋白包被钛片表面(P<0.05),但是光滑钛片和贻贝蛋白包被钛片之间无明显的差异。
　　(2)在0.25,0.5,1和2h各时间点时,成纤维细胞在贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球包被钛片和贻贝蛋白包被钛片表面的粘附结果类似,均明显好于光滑钛片组(P<0.05),有显著的统计学差异。粘附结果还表明,时间点越早,成纤维细胞在贻贝蛋白包被的两种钛表面促粘附效果越好。
　　(3)细胞骨架免疫荧光结果表明:在2、4h时间点时,相比于光滑钛片组,细胞在有贻贝蛋白包被的钛表面表现出更好的细胞伸展形态,出现更多的板状伪足以及应力纤维。24h时间点时,成纤维细胞在贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球包被钛片和贻贝蛋白包被钛片表面伸展情况要明显好于光滑钛片组,出现更多的明显的应力纤维,形成更多更好的细胞间连接。
　　(4)实时定量PCR结果表明:3、6d各时间点时,与光滑钛片组相比,贻贝蛋白以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA复合结构包被的钛表面均促进了ICAM1的表达(P<0.05),但两包被组之间无明显统计学差异(P>0.05)。两包被组分别与对照组相比,6d时ICAM1表达与3d时相比呈现下降的趋势。
　　3、6d各时间点时,与光滑钛片组相比,贻贝蛋白以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA复合结构包被的钛表面均促进了VEGFA的表达(P<0.05);而且两包被组间差别有统计学意义(P<0.05),复合结构包被组促进效果更明显。两包被组分别与对照组相比,6d的VEGFA表达与3d时相比呈现上升的趋势(P<0.05)。
　　3、6d各时间点时,与光滑钛片组相比,贻贝蛋白以及贻贝蛋白/bFGF-PLGA复合结构包被的钛表面均促进了LAMA1的表达(P<0.05),但两包被组之间无明显统计学差异(P>0.05)。两包被组分别与对照组相比,6d时LAMA1表达与3d时相比呈现上升的趋势(P<0.05)。
　　(5)贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被钛片SD大鼠皮下移植表明:炎症反应与光滑钛片以及单纯贻贝蛋白包被钛片类似,均较轻;贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构包被植入大鼠皮下4周后后,材料与皮肤之间结合强度较光滑钛片组明显增加。
　　【结论】:
　　(1)利用手动涂覆法成功地在钛表面构建出单纯贻贝蛋白涂层,通过比较两种贻贝足丝蛋白提取物Usun-afix和BDCELL-TAKTM试剂包被的钛表面特性,发现两者在表面形貌以及在促进成纤维细胞的粘附和增殖方面具有类似的效果:均明显促进其在材料表面粘附,而蛋白本身对成纤维细胞的增殖能力没有明显的影响。
　　(2)本研究采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)作为载体材料,应用W/O/W复乳化溶剂蒸发法为实验方法成功制备碱性成纤维生长因子-聚乳酸羟基乙酸共聚物微球(bFGF-PLGA-MS)。微球的粒径均一、包封率、缓释量等各项指标均能较好地满足实验及应用要求。
　　(3)依靠贻贝蛋白天然的吸附作用以及静电吸引作用,成功在光滑的钛表面构建贻贝蛋白/bFGF-PLGA复合结构。该复合结构制备简单,结构稳定。与光滑钛片表面相比,C、N元素含量明显增高,材料表面自由能明显增大。

目录

封面

声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一．经皮种植体的定义

二．经皮种植体失败的原因

三．种植体与组织结合界面形成过程

四．纯钛种植体表面处理方法及研究方向

五．贻贝蛋白生物学特性及目前的研究现状

六．碱性成纤维细胞生长因子缓释微球的研究现状

正 文

第一部分 钛表面贻贝蛋白包被对人真皮成纤维细胞粘附和增殖的初步研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 总结

第二部分 纯钛表面贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构的构建及表面性状分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 总结

第三部分 纯钛表面贻贝蛋白/bFGF-PLGA微球复合结构对人成纤维细胞生物学功能的影响

1 材料

2 方法

3 结果

3 讨论

4 总结

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致 谢