Ghrelin信号通路在雄性瘦素缺失小鼠不育中的作用研究

摘要

目的：
　　Ghrelin是一种起效迅速的激素,主要在下丘脑和胃中表达,通过与其特异性受体GHS-R结合,调控GH分泌和摄食。多项研究已证实ghrelin可多向性调节生殖系统稳态;在正常成年大鼠睾丸ghrelin主要表达于睾丸间质细胞并可在睾丸局部抑制间质细胞雄激素分泌;而瘦素缺失的雄性ob/ob小鼠不育,其血清雄激素浓度降低。已知leptin和ghrelin为参与体内能量代谢中枢调节的一对相互拮抗关键分子,而能量代谢紊乱是导致精子发生障碍的重要原因,据此我们推测后者在ob/ob雄性小鼠中可能通过调控间质细胞雄激素的生成进而参与其不育表型的形成。为进一步明确ghrelin在雄性ob/ob小鼠生殖中作用,我们研究了ghrelin及其受体GHS-R1α在WT、ob/ob小鼠中的表达变化,并对其可能的作用机制进行了探讨。
　　方法：
　　1.使用4％多聚甲醛固定的WT小鼠和ob/ob小鼠睾丸组织,进行HE染色、免疫组织化学染色,了解ghrelin和GHS-R1α在WT小鼠和ob/ob小鼠睾丸中的表达定位,使用蛋白质免疫印迹、实时定量PCR进一步研究ghrelin和GHS-R1α在睾丸的总体表达水平。
　　2.使用单剂量GHS-R1α的拮抗剂[D-Lys-3]-GHRP-60.1ml/10g腹腔注射ob/ob小鼠3天、7天、14天,建立ghrelin/GHS-R1α信号通路抑制小鼠模型,采用HE染色、PAS染色、免疫组织化学染色、TUNEL染色、蛋白质免疫印迹、实时定量PCR研究睾丸组织形态、生精周期、生精细胞凋亡等变化。
　　3.采用心脏取血,取ob/ob小鼠血液行RIA分析,并结合实时定量PCR分析雄激素合成限速酶的表达变化,检测血清睾酮含量变化。
　　结果：
　　1.在WT和ob/ob小鼠睾丸中,ghrelin均表达于睾丸间质细胞胞质,ob/ob小鼠睾丸间质细胞ghrelin较WT小鼠相比,ghrelin免疫反应产物呈强阳性。蛋白质印迹显示ob/ob小鼠睾丸中ghrelin表达水平增高。
　　2.GHS-R1α在WT和ob/ob小鼠睾丸中均表达于睾丸间质细胞、支持细胞及生精细胞,其中GHS-R1α染色阳性最强部位为长形精子。免疫组化和蛋白质印迹发现ob/ob小鼠GHS-R1α表达水平显著上升。
　　3.Ob/ob小鼠较WT小鼠相比,生精阻滞,生精细胞凋亡数目增加,生精周期紊乱。Ob/ob小鼠生精阻滞小管主要为两类:一是停滞于减数分裂前;而是停滞于精子形成周期的13期。
　　4.随着单剂量GHS-R1α的拮抗剂[D-Lys-3]-GHRP-6注射时间的延长,ob/ob小鼠血清睾酮及促黄体生成素浓度逐渐升高,RT-qPCR显示睾丸中雄激素生成限速酶的升高趋势与睾酮升高趋势一致。
　　5.TUNEL染色提示:[D-Lys-3]-GHRP-6处理后,注射各时间点ob/ob小鼠睾丸生精小管中凋亡的生精细胞数目的百分比分别下降了47.6%,76.3%和91.2%,各处理组TUNEL阳性细胞数较对照组相比显著减少(P<0.05)。蛋白质免疫印迹显示凋亡蛋白bax表达逐渐减少而抗凋亡蛋白bcl-2表达逐渐增多。
　　6.PAS染色和HE染色显示,随着[D-Lys-3]-GHRP-6处理时间的延长,ob/ob小鼠生精阻滞小管数目逐渐减少,生精周期逐步恢复正常。
　　结论：
　　1.Ghrelin及其受体GHS-R1α在ob/ob小鼠睾丸中表达水平异常升高。
　　2.系统性抑制ghrelin/GHS-R1α信号通路可以促使ob/ob小鼠睾丸雄激素分泌增多,抑制生精细胞凋亡,改善生精周期,促进精子发生。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、Ghrelin概况

二、瘦素概况

三、雄激素在精子发生中的作用及其生成调节

四、生精细胞发育

五、精子发育的形态特点

六．生精细胞凋亡机制及意义

七. Ghrelin和leptin在机体能量代谢中的相互关系

正文

1实验材料和方法

2 实验结果

实验一 Ob/ob小鼠睾丸中ghrelin及其受体GHS-R1α的表达

实验二 Ghrelin受体拮抗剂注射后ob/ob小鼠性激素水平变化

实验三 Ghrelin受体拮抗剂注射后ob/ob小鼠睾丸生精细胞凋亡变化

实验四 GHS-R1α拮抗剂注射后ob/ob小鼠睾丸形态变化

实验五 GHS-R1α拮抗剂注射后ob/ob小鼠生精周期变化

3.讨论

4.小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢