电鱼小脑浦肯野细胞对急性缺氧的功能反应

摘要

缺氧性脑损伤可发生于新生儿期多种疾病过程中,如新生儿窒息、新生儿缺氧缺血性脑病、新生儿呼吸窘迫综合征等,是导致新生儿死亡和小儿神经系统后遗症的主要原因。因此,阐明缺氧性脑损伤的病理机制对开发安全高效的神经保护剂,从而有效降低新生儿的死亡率和儿童致残率有着重要的社会意义。
　　缺氧性脑损伤是一个多因素参与的复杂过程,目前认为伴随以细胞膜去极化的突触传递衰减是哺乳类动物和其他非耐缺氧动物脑组织缺氧时发生的最早事件,神经元可在数分钟内因能量依赖性的离子泵衰竭和兴奋性氨基酸毒性而导致功能障碍或死亡。与哺乳类动物不同,缺氧耐受动物能够通过降低代谢率在无氧或低氧状态下生存数日甚至数月。因此,研究缺氧耐受动物的缺氧反应机制,应是发现缺氧性脑损伤神经保护机制的一个重要途径。
　　大量研究已证实,在低氧条件下,缺氧耐受动物有别于哺乳类动物的最显著的神经化学变化是抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)水平增高,兴奋性氨基酸谷氨酸水平降低。然而,缺氧耐受动物的神经元在缺氧条件下的功能活动如何变化尚不清楚。因此,本研究在缺氧耐受动物电鱼脑片上,采用全细胞膜片钳记录法,观察了急性缺氧对小脑主神经元浦肯野细胞(Purkinjecell,PC)电生理特征和突触传递的影响,目的是阐明缺氧耐受动物神经元的缺氧反应特征,并借鉴其神经保护机制,为开发安全高效的神经保护剂奠定理论基础。
　　方法
　　实验一:急性缺氧对电鱼小脑PC兴奋性的影响
　　使用全细胞膜片钳记录法,在电鱼缺氧脑片上记录PC膜电位、自发放电频率和诱发动作电位的变化,评价急性缺氧对电鱼小脑PC基本电生理特征的影响。
　　实验二:急性缺氧对电鱼小脑PC自发性微小突触后电流的影响
　　在电鱼缺氧脑片上记录PC自发性微小兴奋性突触后电流(minitureexcitatorypostsynapticcurrent,mEPSC)和自发性微小抑制性突触后电流(minitureinhibitorypostsynapticcurrent,mIPSC)的变化,评价急性缺氧对电鱼小脑神经网络突触传递的影响。
　　实验三:急性缺氧对电鱼小脑PF-PC突触传递的影响
　　在电鱼缺氧脑片上记录刺激平行纤维(parallelfiber,PF)诱发的PC兴奋性突触后电流(excitatorypostsynapticcurrent,EPSC)和EPSC双脉冲增强现象(pair-pulsefacilitation,PPF)的长时程变化,评价急性缺氧对电鱼小脑最重要的兴奋性突触PF-PC突触传递及其可塑性的影响。
　　结果
　　1.急性缺氧使电鱼小脑PC膜电位发生迅速而持久的超极化,可持续30min以上,同时伴随自发放电频率的显著下降。谷氨酸α-氨基-3-羧基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(α-amino-3hydroxy-5-methyl-isoxazole-propionicacid,AMPA)受体阻断剂6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dike-tone,CNQX)可阻断缺氧性超极化的晚期阶段,并呈现缓慢的去极化;而GABAA受体阻断剂荷包牡丹碱(Bicuculline)则完全阻断缺氧性超极化的产生,并使膜电位在缺氧开始后发生迅速而短暂的去极化。缺氧使PC诱发动作电位的阈值增高,频率减低,幅值减小。
　　2.急性缺氧使电鱼小脑PC的自发性mEPSC和mIPSC的频率均稳态上调。
　　3.急性缺氧使刺激PF诱发的PCEPSC呈现长时程增强(longtermpotentiation,LTP),同时使EPSCPPF显著衰减。CNQX逆转了PFEPSC的缺氧性LTP,表现为长时程抑制(longtermdepression,LTD);而Bicuculline则使PFEPSC的缺氧性LTP增强。
　　结论
　　本研究结果显示,耐缺氧动物电鱼小脑PC对急性缺氧的反应与哺乳类动物神经元显著不同。主要差异有二:一是急性缺氧时PC迅速超极化,可持续30min以上,同时伴随兴奋性降低;二是急性缺氧使电鱼小脑兴奋性突触传递和抑制性突触传递均稳态上调。上述变化均需要AMPA受体介导的兴奋性突触活动和GABAA受体介导的抑制性突触活动的共同参与。这些结果强烈提示,维持谷氨酸能突触活动和GABA能突触活动的适度平衡可能是电鱼以及其他耐缺氧动物神经保护机制的关键。这可能也是为什么大鼠体外实验具有神经保护作用的谷氨酸拮抗剂或GABA受体激动剂用于体内却无明显疗效的重要原因。

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实验一 急性缺氧对电鱼小脑 PC 兴奋性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 急性缺氧对电鱼小脑 PC 自发性微小突触后电流的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 急性缺氧对电鱼小脑 PF-PC 突触传递的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

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