先天缺牙致病基因的筛查及遗传学研究

摘要

牙齿发育是上皮和间充质之间相互作用的复杂过程,许多转录因子和信号分子参与其中。牙齿发育不良(hypoplasiaofteeth)是人类最常见的颅面先天畸形,包括牙齿数目、形状和结构异常。牙齿数目异常,即先天缺牙(congenitaltoothagenesis)是人类牙列中最常见的发育异常。在人群中,单颗牙齿先天缺失比例可高达20％。在排除第三磨牙缺失比例的情况下,恒牙缺失的发病率为1.6%-9.6%,乳牙先天缺失的发病率较低。除第三磨牙外,第二前磨牙和侧切牙最容易受累。按缺牙数一般分为少数牙缺失(hypodontia)、多数牙缺失(oligodontia)以及全口无牙(anodontia)。其中,少数牙缺失指缺失牙齿数少于6颗;多数牙缺失指牙齿先天缺失6颗及以上(不包括第三磨牙)。牙齿先天缺失可由环境因素或遗传因素造成。临床上可见到散发病例和家族遗传病例,后者可以是常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传或X染色体连锁遗传。先天缺牙不仅影响患者的咀嚼功能,而且影响其发音、容貌及心理健康。按照是否伴有其他组织器官改变,先天缺牙可分为综合征型和非综合征型。外胚叶发育不良综合征(ectodermaldysplasiasyndrome,EDs)是临床上最常见的综合征型先天缺牙。患儿除了先天缺牙,还伴发其他外胚层来源组织的发育障碍,如指甲、皮肤、毛发及汗腺。临床以排汗障碍严重程度,又分为少汗型和无汗型两种。
　　大量研究表明,与先天缺牙相关的基因有200余种,一般认为PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因与非综合征型先天缺牙密切相关,而最常见的综合征型先天缺牙——外胚叶发育不良综合征,其致病基因主要为EDA、EDAR及EDARADD。
　　本研究通过临床检查收集先天缺牙家系,对相关候选基因进行检测并初步预测其功能改变,探讨先天缺牙患者的基因突变位点及发病机制。
　　第一部分先天缺牙家系病例调查和样本收集
　　1.材料及方法:本研究收集有先天缺牙临床表现的病例,以先证者恒牙或乳牙先天缺失数目大于或等于6颗为基本纳入标准,收集前来我科就诊的无血缘关系的7个家系。以是否伴有毛发及汗腺发育异常分为综合征型先天缺牙(少汗/无汗型外胚叶发育不良)及非综合征型先天缺牙,绘制先天缺牙家庭家系图谱,对家庭成员进行相关临床检查及病史采集,分别分析两种类型先天缺牙的遗传方式,了解各自发病特点。采集相关实验室所需样本,提取后妥善保存。
　　2.结果:7个家系均为中国汉族人群,包括5例非综合征型先天缺牙家系及2例少汗/无汗型外胚叶发育不良家系。各家庭成员均无其他先天发育缺陷。家族中无近亲婚史,亦无流产史。非综合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及侧切牙,对于同侧颌,同一牙位,侧切牙缺失数目上颌多于下颌,而切牙缺失数目下颌多于上颌。对于第二前磨牙上下颌基本无差异。除一个家系中先证者乳恒牙全部缺失外,少汗/无汗型外胚叶发育不良患儿先天缺牙程度明显较重。7个家系中,除家系5及家系7外,结合相关疾病常见遗传方式,我们认为家系1是常染色体显性遗传,家系2及家系6为X染色体显性遗传,家系4为X染色体显性遗传或常染色体显性遗传。采集提取到了合格的DNA及cDNA样本。
　　3.结论:先天缺牙遗传病的遗传特征可能是X染色体显性遗传或常染色体显性遗传。非综合征型先天缺牙受累牙位主要集中在第二前磨牙及侧切牙,就同一牙位而言侧切牙缺失易发生在上颌,而切牙缺失易发生在下颌。
　　第二部分先天缺牙家系候选基因筛查及突变位点确定
　　1.材料及方法:查阅文献结合DNAStar及Premier5.0软件设计合成候选基因(PAX9、MSX1、AXIN2、EDA、EDAR、EDARADD)引物。对非综合征型先天缺牙家系PAX9、MSX1、AXIN2和EDA基因外显子进行PCR扩增,PCR产物纯化后测序。对于少汗/无汗型外胚叶发育不良的家系先检测EDA基因,后续检测EDAR及EDARADD基因。所有测序结果参照GENEBANK相关序列进行比对,将测得的突变位点同正常人群样本比对,并查询数据库排除常见SNP位点,最终结合相关数据库及文献查新。
　　2.结果:本研究在2个非综合征型先天缺牙家系中分别发现2个新的EDA基因错义突变:p.G257R,p.V309L;发现一个新的MSX1内含子剪切位点突变:IVS1-2A>T;发现一个已报道PAX9基因错义突变:p.R47W。在一个无汗型外胚叶发育不良家系中发现2个新的EDA基因错义突变:p.L296V,p.E308D。另一个少汗型外胚叶发育不良家系经基因测序验证为散发病例,患儿存在一个新的EDA基因错义突变:p.E308K。这5个EDA基因突变位点均位于TNF区域。
　　3.结论:上述3个基因新突变位点的发现证明非综合征型先天缺牙可能与致病基因PAX9、MSX1及EDA有关;并进一步验证了EDA为综合征型先天缺牙的致病基因,同时扩大了以上基因的突变谱。
　　第三部分先天缺牙家系突变基因及其突变位点结构功能预测
　　1.材料及方法:通过剪切位点预测网站比较突变前后MSX1内含子剪切位点的变化。另外,对本研究发现的5个EDA基因新突变进行保守性分析,模拟其蛋白产物三聚体三维结构,并与野生型EDA基因相对比,分析蛋白表面构象及分子表面能量电场差异等,探讨基因型与表现型的联系。
　　2.结果:剪切位点预测显示IVS1-2A>T突变对MSX1基因内含子剪切产生重要影响。本研究发现的5个EDA基因突变位点,均有高度保守性。突变EDA基因的蛋白产物,因氨基酸发生改变(碱基突变后翻译得到氨基酸支链及电荷能量不同),使EDA基因蛋白产物三聚体表面构象及分子表面能量电场都发生了较大改变。
　　3.结论:EDA,MSX1各自的基因突变引起相应蛋白产物结构及功能的改变,可能是造成相应家系先天缺牙的原因。

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文献回顾

正文

第一部分 先天缺牙家系病例调查和样本采集

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 先天缺牙家系候选基因筛查及突变位点确定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 先天缺牙家系突变位点基因结构功能预测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢