HDAC参与瘢痕疙瘩形成的作用及机制研究

摘要

瘢痕疙瘩是皮肤创伤后引发的以成纤维细胞异常增殖并分泌大量细胞外基质(extracellular matrix,ECM)为主要特征的一种皮肤纤维化疾病,治疗效果不佳,复发率较高,发病机制尚不清楚。近年来研究发现,组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)活性增高与多种组织和器官纤维化的发生发展密切相关,使用HDAC抑制剂降低HDAC活性可抑制皮肤正常成纤维细胞ECM的合成。同时HDAC活性增高还是多种肿瘤发生的病理机制,使用HDAC抑制剂可以通过激活凋亡信号,使异常增殖的肿瘤细胞生长停滞,诱导其凋亡。所以我们也推测HDAC活性增加可能与瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和分泌大量 ECM密切相关。本课题将研究 I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况,并使用 HDAC抑制剂TSA进行体内和体外实验进行干预,以期阐明I型HDAC是如何参与瘢痕疙瘩形成的病理机制,为HDAC抑制剂类药物临床应用预防和治疗瘢痕疙瘩提供理论基础。
　　实验一 HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的实验研究
　　目的:本实验旨在研究I型HDAC(HDAC1和HDAC2)在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况,并与正常皮肤成纤维细胞相比较,以期为瘢痕疙瘩提供新的发病机制,及治疗的新切入点。
　　方法:我们首先进行瘢痕疙瘩成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞原代培养。接着通过RT-PCR和western blot方法检测HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况,并与正常皮肤成纤维细胞相比较。
　　结果:我们通过 RT-PCR方法检测发现,瘢痕疙瘩成纤维细胞 HDAC1和 HDAC2 mRNA的表达均比正常皮肤成纤维细胞明显增高。接着,用western blot方法检测同样证实瘢痕疙瘩成纤维细胞HDAC1和HDAC2蛋白的表达也均比正常皮肤成纤维细胞要高。
　　结论:我们的研究证实HDAC1和HDAC2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达明显增高。HDAC1和HDAC2的活性增强,可以使原有的基因表达平衡状态被打破,从而导致细胞增殖、凋亡和纤维化等生物学特征的异常,这可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖并合成大量ECM的病理新机制。
　　实验二 HDAC抑制剂TSA诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的实验研究
　　目的:HDAC抑制剂TSA可以引起多种恶性增殖的细胞生长停滞,促进其发生凋亡,本实验旨在研究 TSA是否可以诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡及 TSA对细胞HDAC1和HDAC2蛋白表达的影响。
　　方法:首先,我们向培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞加入不同浓度的HDAC抑制剂TSA(200 nmol/L、400 nmol/L、600 nmol/L和800 nmol/L),运用MTT法检测TSA对细胞活力的影响。然后,通过Hoechst染色和流式细胞仪检测TSA诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡的作用。最后,运用western blot方法检测TSA对瘢痕疙瘩成纤维细胞HDAC1和HDAC2蛋白表达的影响。
　　结果:通过MTT法检测TSA对细胞增殖的影响,结果发现随着浓度和时间的变化, TSA抑制细胞的增殖存在量效性和时效性的特点。成纤维细胞对于200 nmol/L TSA作用耐受性良好,在600 nmol/L和800 nmol/L TSA作用下,细胞活力明显下降。随后600 nmol/L TSA单独作用瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过Hoechst染色和流式细胞仪检测同样证实TSA可以诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生凋亡。最后,运用western blot方法检测发现600 nmol/L TSA处理瘢痕疙瘩成纤维细胞48 h后,瘢痕疙瘩成纤维细胞HDAC1和HDAC2蛋白的表达明显受到了抑制。
　　结论:我们的研究证实HDAC抑制剂TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,诱导其发生凋亡,这可能是通过抑制HDAC1和HDAC2的表达来实现的。
　　实验三 HDAC抑制剂TSA抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的实验研究
　　目的:本实验旨在研究HDAC抑制剂TSA是否可以抑制TGF-β促瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的作用。
　　方法:我们分别通过RT-PCR和western blot方法检测600 nmol/L TSA单独作用或者联合5 ng/ml TGF-β1蛋白对瘢痕疙瘩成纤维细胞I型胶原(collagen I)mRNA和蛋白表达的影响。
　　结果:通过RT-PCR检测发现,向培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞加入5 ng/ml TGF-β1,可以促进细胞 collagen I mRNA合成,而同时加入600 nmol/L TSA后,可以抑制TGF-β1促进细胞collagen I mRNA合成的作用。单独使用600 nmol/L TSA后这种抑制作用会更加显著。Western blot方法检测同样证实TSA可以抑制细胞collagen I蛋白的合成。
　　结论:我们的研究证实HDAC抑制剂TSA可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成,这就为这种已经在临床治疗多种肿瘤的HDAC抑制剂应用于瘢痕疙瘩临床预防和治疗提供实验基础。
　　实验四 HDAC抑制剂TSA抑制兔耳增生性瘢痕形成的实验研究
　　目的:已证实HDAC抑制剂TSA能够有效抑制体外培养的皮肤成纤维细胞胶原合成而起到抗纤维化作用,本部分实验拟通过兔耳增生性瘢痕模型验证TSA是否能够在体内实验抑制瘢痕的形成。
　　方法:建立兔耳增生性瘢痕模型。每个兔耳做4个直径为1 cm,间距为2 cm的圆形全层皮肤缺损创面。每只兔的左耳为TSA治疗组,分别在创面上皮化后创面局部注射TSA,每个创面使用0.02％TSA0.05 ml。连续注射1周。右耳为对照组,分别在相同时间点局部注射相同剂量生理盐水0.05 ml。术后第23 d收集瘢痕标本,进行RT-PCR和western blot检测collagen I和纤维连接蛋白(fibronectin)mRNA和蛋白的表达情况。术后第45 d收集瘢痕标本,行 HE染色切片计算瘢痕增生指数(scar elevation index,SEI)。
　　结果:TSA治疗组瘢痕比对照组厚度较薄,术后45 d时间点其SEI在TSA治疗组明显下降(1.45±0.09 vs2.07±0.10),差异有统计学意义。同时,RT-PCR和western blot检测也证实在术后第23 d(TSA治疗1周后),TSA可以有效的抑制collagen I和fibronectin表达。
　　结论:我们的研究证实HDAC抑制剂TSA可以在体通过抑制collagen I和fibronectin的合成,有效的抑制兔耳增生性瘢痕的形成。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 瘢痕疙瘩发病机制研究的新进展

2 瘢痕疙瘩药物治疗的新进展

3 组蛋白乙酰化研究新进展

正文

实验一 HDAC 1和HDAC 2在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达的实验研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 HDAC抑制剂TSA诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的实验研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 HDAC抑制剂TSA抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的实验研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 HDAC抑制剂TSA抑制兔耳增生性瘢痕形成的实验研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢