XIAP蛋白在过氧化氢诱导的牙周膜细胞凋亡中的机制研究

摘要

研究背景和目的:
　　细胞的凋亡可以由多种因素诱导,而氧自由基对细胞的攻击是其中重要的一种,过氧化氢是一种强氧化剂,他能诱导细胞产生大量的活性氧(ROS),而 ROS会主动攻击DNA双链,导致其发生畸变。过氧化氢(H2O2)是口腔临床治疗中的常用药物,常用于牙齿漂白,牙周冲洗,直接作用于牙龈、牙周组织。但实际上它也是把双刃剑,除了有治疗作用以外,它还可能诱发组织的氧化应激反应,导致细胞死亡。此外,过氧化氢作为关键的氧化代谢产物,在由氧化应激介导的疾病中起着重要的作用。几乎所有的氧化应激反应都产生过氧化氢,其中也包括牙周炎,而牙周炎是导致牙齿松动和脱落最主要的原因之一。越来越多的证据表明过氧化氢能调节细胞的功能,能够引起细胞凋亡和坏死。过氧化氢能够穿透细胞膜,通过影响细胞内的敏感因子,起到信号转导通路中的第二信使作用。研究发现,过氧化氢诱导细胞死亡的方式与细胞的类型、过氧化氢的浓度及剌激的方式有关。XIAP蛋白是新发现的抗凋亡蛋白家族中最强的凋亡抑制因子,它可直接抑制caspases,显示出强效保护细胞免受各种凋亡刺激的作用,并可多途径调节细胞凋亡。
　　目前,关于口腔治疗中使用过氧化氢氧及氧化应激产生的过氧化氢对牙周膜潜在毒性的研究尚少,有关过氧化氢诱导的牙周膜细胞凋亡的机制几乎很少有相关报道。此外,作为重要的凋亡抑制因子,XIAP蛋白在氧化损伤所致人牙周膜细胞凋亡的信号通路中是否起到关键的调控作用,目前尚未可知。因此,对过氧化氢所激发的牙周膜成纤维细胞(HPDL)凋亡的分子机理进行研究,将会为牙周炎症的预防和治疗及牙周组织的修复重建提供重要理论依据。
　　研究内容:
　　本研究主要包括三个实验,实验一:观察牙周膜细胞在过氧化氢刺激下的生物学反应,主要包括细胞形态学变化,细胞增殖活性、细胞周期、细胞凋亡率。实验二:过表达和基因沉默XIAP蛋白后,牙周膜细胞的活性变化。实验三:研究XIAP蛋白在抗凋亡激酶信号通路中的调控机制。
　　研究方法:
　　利用HE染色以及波形蛋白染色技术鉴定并建立人牙周膜细胞系,首先分别通过MTT对细胞存活性的检测,以及流式细胞仪对细胞周期的分析,TUNEL法以及流式细胞仪 PI-FITC双染色法并配合光学显微镜、荧光显微镜、对细胞凋亡的检测并建立过氧化氢诱导的牙周膜细胞凋亡模型,然后通过Western blotting以及免疫荧光在激光共聚焦显微镜的配合下判定在该模型中XIAP蛋白的表达情况,利用分子克隆技术分别过表达或者基因沉默XIAP的手段研究XIAP在此凋亡模型中的作用,同时检测不同信号通路AKT、JNK2、以及GSK3β分子通路与XIAP在此凋亡模型中的相互关系,最后在过表达或者基因沉默XIAP蛋白的情况下,分别使用过氧化氢再次处理细胞,并使用western blotting以及酶联免疫技术对此过程中细胞内分子机制进行探讨,分别检测Casepase-3,Casepase-8,PTEN蛋白。
　　结果:
　　1.分别使用梯度浓度的过氧化氢作用牙周膜细胞后,MTT检测结果显示,处理细胞24h,当过氧化氢浓度高于125μM时,细胞存活率显著下降,通过TUNEL法以及流式细胞仪检测到250μM过氧化氢作用72h后能够检测到36.5％的细胞凋亡率,确定过氧化氢诱导的牙周膜细胞凋亡模型建立成功。
　　2.72h250μM的过氧化氢作用下,Western blotting结果显示XIAP蛋白水平下降(p<0.05),同时检测到JNK2、AKT、PAKT,以及 GSK3β蛋白水平同对照组相比也有显著性下降,激光共聚焦结果也显示 AKT、PAKT蛋白水平明显下降。使用250μM过氧化氢处理细胞,随着作用时间的增加,24h、48h、72h后western blotting检测到细胞内Caspase-3、Caspase-8、PTEN蛋白的含量随之升高,与对照组相比具有显著性(p<0.05)。
　　3.当对细胞进行过表达XIAP后,细胞内JNK2、AKT、PAKT,以及 GSK3β蛋白的表达没有明显变化,72h250μM的过氧化氢同时作用过表达 XIAP与正常细胞,过表达XIAP细胞内JNK2、AKT、PAKT,以及GSK3β蛋白水平比正常细胞高(p<0.01),且具有显著性意义,同时,过表达组过氧化氢处理后,MTT以及细胞周期和细胞凋亡流式细胞仪检测到细胞存活率显著上升,激光共聚光显微镜显示,过表达XIAP后,72h250μM过氧化氢处理后,c-jun以及AP-1蛋白的表达显著上升。
　　4.在基因沉默的作用下,MTT检测到细胞存活率与对照组相比显著下降,JNK2,AKT,PAKT,以及GSK3β蛋白表达水平与对照组相比也显著下降。
　　结论:
　　1.过氧化氢(H2O2)对牙周膜细胞生长的抑制随着浓度的升高及作用时间的延长而增强
　　2.H2O2诱导牙周膜细胞凋亡最佳的模型为:H2O2的浓度250μM,作用细胞的时间为72h。
　　3.H2O2通过诱导XIAP蛋白表达水平的下降,抑制XIAP蛋白与凋亡执行蛋白Caspase-3的结合,致使牙周膜细胞凋亡的发生,而XIAP蛋白的表达对细胞的活性有显著的影响。
　　4.AKT、JNK2、GSK3β蛋白在H2O2诱导牙周膜细胞凋亡的机制中起着重要作用,XIAP蛋白可能是通过调节这三条信号通路,使这三种蛋白表达水平保持在正常水平从而实现抗凋亡效应。
　　5.XIAP蛋白激活C-jun和AP-1这两种转录因子的表达,其可能的机制为XIAP蛋白正向调节JNK2,通过磷酸化C-jun而实现。
　　6.XIAP蛋白对AKT的修复作用可能通过抑制PTEN的表达来实现。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 过氧化氢

2 牙周膜细胞凋亡的因素

3 牙周膜细胞凋亡的信号通路

4 牙周膜细胞凋亡信号的转导通路

5 XIAP蛋白与细胞凋亡

6凋亡信号通路中的关键蛋白

正文

实验一 牙周膜细胞在氧化应激状态下的生物学反应

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 基因过表达和沉默XIAP蛋白后，牙周膜细胞的活性变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 XIAP蛋白在氧化应激状态下牙周膜细胞凋亡信号通路中的调控机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

临 床 病 例 报 告