Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中喉黏膜间充质干细胞肌向分化能力的调控

摘要

成体干细胞的多向分化和自我更新是组织器官再生修复的基础,然而此生物学特性易受体内炎症微环境的影响。喉黏膜间充质干细胞(laryngeal mucosa mesenchymal stem cells,LM-MSCs)是分离培养喉黏膜获得的间充质干细胞,因其与声带均发育于中胚层,且同属于喉部结构,故用于修复声带组织损伤具有巨大潜能。本课题组前期分离、培养和鉴定了 LM-MSCs,并将其注射至激光损伤的声带,分别于2w、4w和8w观察声带组织修复情况,实验证实,LM-MSCs用于声带修复可以有效的减轻声带水肿、瘢痕的形成,且细胞可在体内存活长达8w以上,并可向肌成纤维细胞转化,表明LM-MSCs可有效修复声带损伤。然而,在临床手术切除声带病变组织的同时也会引起声带急性炎症的形成。急性炎症对LM-MSCs生物学特性的影响势必将会影响LM-MSCs修复组织损伤的功能。
　　Wnt信号通路是人体生长、发育过程中重要的信号通路,其在多种疾病发生、发展过程中发挥重要的作用。Wnt信号通路主要可分为决定细胞命运的经典Wnt/β-catenin信号通路和与组织极性及细胞运动密切相关的非经典通路。其中,有研究表明Wnt/β--catenin信号通路参与了正常及炎症微环境下细胞增殖、分化能力的调控。在炎症微环境牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化能力下降,用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂DKK1下调通路,可部分或全部逆转PDLSCs的成骨分化能力。
　　综上,我们在体外模拟炎症微环境并探讨其对LM-MSCs成脂、成骨和成肌多向分化能力的影响,考虑声带组织的特殊性,我们重点研究炎症微环境对 LM-MSCs成肌分化能力的影响。并用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂或激活剂调控通路,以期恢复炎症微环境中LM-MSCs的成肌分化能力。
　　研究目的:
　　探讨炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力如成骨、成脂及成肌分化能力的影响,揭示炎症条件下Wnt/β-catenin的变化作用规律,通过在Wnt/β-catenin信号通路分子水平上进行调控,以期恢复炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力,最终促进LM-MSCs修复声带组织损伤及组织再生。
　　研究方法:
　　1.LM-MSCs分离培养、鉴定与多向分化能力的研究:用消化法分离培养会厌舌面黏膜组织获得LM-MSCs,流式细胞仪检测干细胞表面标志物 CD105,CD90,CD44,CD34,CD14和CD31表达情况;将细胞向成骨诱导分化21d后行茜素红染色,鉴定其成骨分化能力;将细胞向成脂细胞方向诱导分化14d后行油红O染色,鉴定其成脂分化能力;将细胞向成肌细胞方向诱导分化1w、3w和6w后,行免疫荧光化学染色和实时定量检测(RT-PCR)检测其成肌分化能力。
　　2.炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力的影响:用10ng/ml的TNF-α和5ng/ml的IL-1β在体外模拟炎症微环境,将细胞在炎症和正常微环境分别向成骨、成脂和成肌方向诱导分化,在成骨诱导分化后的7d和21d分别行碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色,并将生成的矿化结节溶解下来行定量检测;在成脂诱导分化14d行油红O染色,并将脂滴溶解下来行定量检测;在成肌诱导分化的1w、3w和6w提取细胞蛋白和基因,用RT-PCR和Western Blot蛋白印迹检测技术检测成肌初始基因和蛋白Myod1、成肌分化标志性基因和蛋白Myogenin(Myog)和成肌分化终末基因和蛋白 myosin heavy chain（MyHc)表达情况;并检测Wnt/β-catenin信号通路中重要的信号分子GSK3β、P-GSK3β和β-catenin蛋白和基因表达情况,以检测Wnt/β-catenin信号通路在炎症微环境LM-MSCs成肌分化过程中所处的状态。
　　3.Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控:体外实验中,分别用DKK1下调炎症微环境和Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化过程中Wnt/β-catenin信号通路,并检测成肌分化相关蛋白和基因表达情况;按体外实验分组情况制备成肌分化的细胞胶原团块,并将其移植至裸鼠皮下2w,取出移植物,行 HE染色观察组织学行为,Masson三色染色和观察细胞成肌分化情况,行免疫荧光化学染色观察成肌分化相关蛋白表达情况。
　　结果:
　　1.LM-MSCs分离培养、鉴定与多向分化能力的研究:用消化法分离培养会厌舌面黏膜组织,可获得LM-MSCs,其可贴壁生长,呈长梭形,阳性表达间充质干细胞表面分子标志CD105(94.2％),CD90(99.5%)和CD44(99.8%),不表达造血系和内皮细胞系干细胞表面标志物CD34(0.6%),CD14(0.7%)和CD31(0.5%)。细胞经成骨诱导分化21d并行茜素红染色,可见细胞中有矿化结节着红色;细胞经成脂诱导分化14d后并经油红O染色后,可见细胞中串珠样脂滴红染;将细胞向成肌细胞方向诱导分化1w、3w和6w后,行免疫荧光化学染色和RT-PCR检测成肌相关基因和蛋白表达情况,可见初始基因和蛋白Myod1和成肌分化特异性标志蛋白和基因Myog于成肌诱导分化后1w开始表达,并可持续表达于成肌诱导分化6w,成肌分化终末标志蛋白和基因MyHc于成肌诱导分化3w时表达,持续表达于成肌诱导分化6w。
　　2.炎症微环境对LM-MSCs多向分化能力的影响
　　2.1、炎症微环境对LM-MSCs成骨分化能力影响:炎症和正常微环境中将LM-MSCs向成骨细胞诱导分化,并分别行 ALP染色、茜素红染色,结果可见,细胞在炎症和正常微环境中成骨诱导分化7d后ALP染色均可着蓝染,而炎症微环境下细胞着色浅;成骨诱导分化21d后行茜素红染色,可见炎症微环境下细胞着红染色矿化结节少于正常微环境,表明炎症微环境抑制LM-MSCs骨向分化。
　　2.2、炎症微环境对LM-MSCs成脂分化能力影响:炎症和正常微环境中将细LM-MSCs向成脂细胞诱导分化,并于诱导分化14d后行油红O染色,炎症和正常微环境LM-MSCs脂向分化过程中均有脂滴生成,而炎症微环境中串珠样脂滴形成较少,表明炎症微环境抑制LM-MSCs脂向分化。
　　2.3、炎症微环境对LM-MSCs成肌分化能力影响:炎症和正常微环境中将LM-MSCs向成肌细胞诱导分化,并分别于诱导分化后1w、3w和6w提取细胞基因和蛋白,行 RT-PCR和Western Blot检测成肌相关蛋白和基因,可见炎症微环境中LM-MSCs肌向分化过程中成肌分化相关蛋白和基因均较对照组表达量降低。
　　3.Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控
　　3.1、体外实验:分别用DKK1下调炎症微环境和Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化过程中Wnt/β-catenin信号通路,并检测成肌分化相关蛋白和基因表达情况,可见经DKK1干预后炎症微环境中LM-MSCs成肌相关蛋白和基因表达量较炎症组增高,加入Wnt3a上调正常微环境中LM-MSCs成肌分化,可见成肌相关蛋白和基因表达量与炎症组都较正常减弱,表明下调Wnt/β-catenin信号通路可逆转炎症微环境对LM-MSCs成肌分化的抑制作用,而上调通路则可抑制正常微环境中LM-MSCs的成肌分化。
　　3.2、体内实验:按体外实验分组情况制备成肌分化的细胞胶原团块,并将其移植至裸鼠皮下2w,取出移植物,行HE染色观察组织学行为,Masson三色染色和观察细胞成肌分化情况,行免疫荧光化学染色观察成肌分化相关蛋白表达情况,其结果与体外实验结果一致,表明下调Wnt/β-catenin信号通路可逆转炎症微环境对LM-MSCs成肌分化的抑制作用,而上调通路则可抑制正常微环境中LM-MSCs的成肌分化。
　　结论:
　　1.炎症微环境对LM-MSCs成骨分化能力影响:LM-MSCs属于间充质干细胞,具有向成骨、成脂及成肌细胞方向分化的能力。
　　2.炎症微环境对 LM-MSCs多向分化能力的影响:炎症微环境对LM-MSCs成骨、成脂及成肌细胞分化均具有抑制作用。
　　3.Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中LM-MSCs肌向分化能力的调控:通过下调Wnt/β-catenin信号通路可一定程度逆转炎症微环境对LM-MSCs肌向分化能力的抑制作用。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、LM-MSCs用于声带注射的实验研究

二、炎症微环境对间充质干细胞生物学特性的影响

三、Wnt/β-catenin信号通路对间充质干细胞多向分化能力的调控

实验一 喉黏膜间充质干细胞多向分化能力的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 炎症微环境对喉粘膜间充质干细胞多向分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 Wnt/β-catenin信号通路对炎症微环境中喉粘膜间充质干细胞肌向分化能力的调控

1 材料和实验动物

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢