CKIP-1在小鼠皮肤创伤愈合中的作用

摘要

实验一小鼠皮肤切创愈合不同时间点CKIP-1和TGF-β1基因的表达
　　目的：观察小鼠皮肤切创愈合中,不同时间点CKIP-1和TGF-β1的表达情况并分析二者的相关性。
　　方法：50只雄性小鼠按照0h、3h、6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d、21d共10个时间点随机分为10组,每组5只。每只老鼠背部剃毛后,在左右两侧距离脊柱中线1cm处做平行于脊柱方向的纵行切口,长1.5cm,伤口不缝合不包扎,保持伤口干燥自然愈合。在每个时间点采用过量麻药注射法处死小鼠,取切创处宽1cm,长1.5cm皮肤全层组织分别用于RT-PCR、Western Blot、HE染色和免疫组织化学染色分析。
　　结果：RT-PCR及Western Blot结果显示CKIP-1和TGF-β1随伤口愈合呈时间依赖性表达,且表达趋势相似,在3d时表达最显著。HE染色结果显示肉芽组织及再上皮化完全覆盖创面时间在7-14d之间。免疫组织化学结果显示,CKIP-1和TGF-β1在肉芽组织及创缘皮肤组织中表达存在区域特异性,TGF-β1在增生最活跃的组织中表达最显著,而 CKIP-1在增生最活跃的组织边缘表达显著。
　　结论：
　　①CKIP-1和TGF-β1在皮肤愈合过程中都有时间依赖性表达且趋势相似。
　　②CKIP-1和TGF-β1在皮肤创伤修复中的表达存在区域特异性,并且CKIP-1可能发挥了阻止组织过度增殖的作用。
　　实验二 CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤创伤愈合速度的比较
　　目的：比较CKIP-1基因敲除型与同窝野生型小鼠皮肤全层伤口愈合速度的差异。
　　方法：8周龄CKIP-1基因敲除型与同窝野生型小鼠(同性别)共12对分为两组,实验组为CKIP-1基因敲除小鼠12只,对照组为野生型小鼠12只。在背部中线两侧,距离中线1cm处分别为中心,用环钻压切出一直径0.6cm皮肤圆形印迹,沿印迹剪去中心圆形皮肤全层,不包扎不缝合,保持伤口干燥自然愈合。在创伤后0d,3d,5d和7d时以涤纶投影膜在伤口表面描绘出伤口面积大小,并将图像信息输入计算机,使用图像分析软件Image-Pro Plus6.0(IPP6.0)分析伤口面积变化。
　　结果：在3d和5d时,CKIP-1基因敲除组和野生组皮肤愈合速度无显著性差异(p>0.05)。而在7d时,两组皮肤愈合速度差异显著(p<0.05)。
　　结论：
　　① CKIP-1基因敲除小鼠皮肤愈合速度较同窝野生型速度快。
　　②CKIP-1可能在皮肤创伤愈合中发挥了负调控作用。
　　实验三 CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤结构和出凝血时间的比较
　　目的：比较CKIP-1基因敲除型与同窝野生型小鼠皮肤结构和出凝血时间的差异。
　　方法8周龄CKIP-1基因敲除型与同窝野生型小鼠(同性别)共20对,随机分为两组,实验组为CKIP-1基因敲除小鼠20只,对照组为野生型小鼠20只。采用剪尾法和玻片法检测小鼠出凝血时间,并在背部中线用手术剪分别切取1cm×1cm大小全层皮肤,立即放入到4％多聚甲醛中固定,用于HE染色及免疫组织化学染色。
　　结果：基因敲除组小鼠出凝血时间均短于野生型小鼠,但无显著性差异(p>0.05)。HE染色见基因敲除型及野生型小鼠皮肤结构基本无差别,表皮及脂肪层厚度等也无明显差异。免疫组化观察TGF-β1表达情况发现,TGF-β1呈散在表达,在两组中表达无明显差别。
　　结论：CKIP-1基因敲除小鼠皮肤结构及出凝血时间与同窝野生型相比无显著性差异。
　　实验四CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤切创愈合和TGF-β1表达差异
　　目的：观察CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤切创愈合和TGF-β1的表达差异。
　　方法：8周龄CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠(同性别)共30对分为两组,实验组为CKIP-1基因敲除型小鼠共30只,对照组为同窝野生型小鼠共30只。皮肤切创检测的时间为0h、3h、6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d和21d共10个时间点,每个时间点随机抽取三对。每只老鼠背部剃毛后,在左右两侧距离脊柱中线1cm处做平行于脊柱方向的纵行切口,长1.5cm,伤口不缝合不包扎,保持伤口干燥自然愈合。在每个时间点采用过量麻药注射法处死小鼠,取纵行伤口处宽1cm,长1.5cm组织分别用于 RT-PCR、Western Blot、HE染色和免疫组织化学染色分析。
　　结果：RT-PCR及Western Blot结果显示TGF-β1随伤口愈合呈时间依赖性表达,在3d时表达最显著,实验组中 TGF-β1的表达高于对照组(p<0.05)。HE结果显示与对照组相比,实验组肉芽组织增生和细胞迁移和聚集更快,胶原纤维也明显增生。免疫组织化学结果显示7d时TGF-β1在两组创伤组织中的表达最显著。
　　结论：
　　①CKIP-1敲除可促进创伤修复中肉芽组织的增殖和细胞的迁移。
　　②CKIP-1可能通过TGF-β1在创伤修复中发挥了负调控作用。
　　实验五CKIP-1及TGF-β1在人增生性瘢痕和正常皮肤中的表达
　　目的：观察CKIP-1及TGF-β1在人增生性瘢痕和正常皮肤中的表达情况。方法实验组为人增生性瘢痕组织,共13例患者,均为手背部烧伤一年后行增生性瘢痕切除手术的患者,中度增生成熟期瘢痕组织。对照组为同一患者腹部正常皮肤(用于皮肤移植)。通过免疫组织化学染色观察CKIP-1和TGF-β1的表达。
　　结果：CKIP-1在增生性瘢痕中的表达明显高于正常皮肤,TGF-β1在增生性瘢痕和正常皮肤中均表达较少。
　　结论：
　　①CKIP-1参与了人增生性瘢痕成熟期的过程。
　　②CKIP-1可能通过TGF-β1通路发挥了抑制瘢痕增生的作用。

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实验一 小鼠皮肤切创愈合不同时间点CKIP-1和TGF-β1基因的表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二 CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤创伤愈合速度的比较

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验三 CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤结构及出凝血时间的比较

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验四 CKIP-1基因敲除型和同窝野生型小鼠皮肤切创愈合对比及TGF-β1的表达差异

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验五 CKIP-1及TGF-β1在人增生性瘢痕和正常皮肤中的表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢