抑制BMSC衰老的小分子化合物的筛选及Apocynin抗衰老作用机制的研究

摘要

我国是世界上老年人口最多的国家,在所有的人群中约有9000万人患有不同程度的骨质疏松,因而骨质疏松的治疗和预防是极为重要的医学课题。在骨衰老的进程中,破骨细胞对骨的吸收速率超过了成骨细胞的骨形成的速率,成骨细胞与破骨细胞之间的骨代谢平衡被打破是骨量下降,骨密度降低的重要因素。而骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的前体细胞,随着衰老进程的加剧,其增殖、分化等能力的出现下降的趋势。而这也直接导致了骨生成的减少,这是骨质疏松发生的一个非常关键的因素。而由于干细胞和骨质疏松等增龄性骨疾病之间的密切联系使得对干细胞的相关调控研究在本领域具有广阔的前景。
　　小分子化合物作为近些年的研究热点,被广泛地应用于对细胞的调控与干预的研究中。本课题的研究以新发现的小分子化合物库为基础,从中筛选出了对骨髓间充质干细胞命运调控具有明显影响的小分子化合物,并对其影响的机制进行了进一步深入的探索,同时在动物模型上对其应用效果进行验证,筛选出了具有明显抑制BMSCs衰老进程的相关小分子化合物。
　　1.研究思路
　　在实验研究开始阶段,我们通过对国家小分子化合物资源中心所提供的24个化合物库中的约14000种小分子化合物进行初步的筛选。首先根据国家小分子化合物资源中心提供的对相关小分子化合物的作用方向的初步描述缩小了筛选范围,通过对相关化合物研究进展的查阅以及其相关作用靶点的分析,最终选定了目前在干细胞治疗领域尚未进行过相关研究,同时具有潜在的干细胞干预能力的小分子化合物共计27种,并应用于接下来的化合物筛选的实验研究当中。
　　在第一部分实验中,首先对SD大鼠的BMSCs进行取材,以获得用于化合物干预实验的衰老的骨髓间充质干细胞(aging-BMSCs),随后使用选定的27种小分子化合物以梯度浓度(1000μM、100μM、10μM、1μM)分别对细胞进行干预。随后通过使用实时定量PCR(RT-PCR)的方法对选定的27种小分子化合物作用于骨髓间充质干细胞的相关靶点进行了mRNA水平的检测。此处选用了与干细胞衰老进程密切相关的靶点β–gal、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT作为筛选靶点进行定量的检测。在这一步中,我们通过对相关基因表达的定量分析初步获得了11种对筛选靶点作用效果明显的小分子化合物及其最佳作用的浓度。随后我们通过对这11种选出的小分子化合物在同一批样本中进行了横向的对比,对其作用的效果进行了排序,并最终选定了5种小分子化合物用于进一步的研究中(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9)。
　　在第二部分实验中,我们对选定的5种小分子化合物以最佳作用浓度对aging-BMSCs进行干预,并对细胞进行了与衰老相关的多靶点的检测。通过MTT细胞增殖实验,我们对细胞的增殖能力进行了检测;通过细胞SA-β–gal活性染色实验。对细胞β–半乳糖苷酶活性及衰老状态进行检测;通过RT-PCR实验以及WesternBlot实验在mRNA水平和蛋白水平分别检测细胞衰老和分化方面的改变;通过ALP染色、茜素红(AlizarinRed)染色、ALP活性定量检测来观察在对细胞进行成骨诱导后,细胞在分化水平的改变;通过流式技术(FlowCytomery)检测来对细胞周期、细胞凋亡进行相关的检测。在本部分的实验中,我们发现选定的5种小分子化合物均具有明显逆转或延缓衰老骨髓间充质干细胞衰老进程的作用。
　　在第三部分实验中,我们对小分子化合物Apocynin抗衰老的作用进行了更加细致的研究。首先我们在体外实验中对apocynin作用于aging-BMSCs的分子机制进行了探索。通过对NADPHOxidase活性的定量检测、细胞内活性氧(ROS)水平定量检测及定性检测等实验我们发现了apocynin在衰老骨髓间充质干细胞中改变衰老进程的相关分子信号通路及其作用的方式。同时,我们通过使用SAMP6早衰小鼠模型对apocynin的作用进行了进一步的体内检测。我们发现apocynin的作用明显改善了p6小鼠的骨质疏松及骨衰老的进程。通过Micro-CT检测apocynin干预下其骨密度、骨量的改变;通过TRAP-ALP组织切片染色来检测apocynin对骨组织中成骨-破骨细胞平衡的改变情况。同时对SAMP6小鼠的BMSCs进行取材,通过相关体外实验检测其在衰老与分化方面的改变情况。
　　2.实验结果
　　第一部分小分子化合物的筛选
　　1)通过对国家小分子化合物资源中心提供的化合物库进行初步的梳理分析,我们从中心提供的24个化合物库中选定了8个列出小分子化合物初步作用靶点或方向的化合物库进行筛选,从这8个库中对其列出的每个小分子化合物采用一定的筛选标准进行筛选。
　　2)根据所列出的小分子化合物的初步作用靶点,我们选出了与干细胞治疗或调节干细胞命运密切相关的小分子化合物共计27种并订购,开展下一部分的研究。
　　3)通过对雄性22月大的SD大鼠进行BMSCs的取材,并对所获得的细胞进行衰老鉴定,确认了用于筛选的细胞模型符合预定标准。
　　4)将27种小分子化合物稀释成不同的浓度梯度(1000μM、100μM、10μM、1μM)分别对细胞进行干预,并对干预后的细胞进行总mRNA的收集用于RT-PCR的检测。通过对靶点β–gal、p53、p21、p16、Nanog、Oct-4、TERT的检测来判断其对细胞衰老进程的影响程度。据此我们选出了11中具有明显作用的小分子化合物及其作用于细胞的最佳浓度。
　　5)接下来在同一批细胞样本中对选定的11种小分子化合物进行了横向的比对,使用RT-PCR检测其作用效果,并对其影响结果进行了定量的排序。从中选出了作用效果最好的5种小分子化合物(apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9)进行后续的实验研究。
　　第二部分小分子化合物对Aging-BMSCs的细胞行为学的影响
　　1)在对细胞衰老进程相关指标的检测中,我们发现apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644、H-9均在不同程度上对细胞的衰老进程产生了影响。
　　2)我们对衰老的骨髓间充质干细胞进行了成骨分化诱导,并使用选定小分子化合物干预其分化的过程。在对细胞分化相关指标的检测中,我们发现apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644在分化的不同阶段中,均促进了aging-BMSCs的骨向分化能力。
　　第三部分Apocynin的作用分子机制及其体内应用效果的研究
　　1)本部分我们对apocynin在aging-BMSCs中的分子机制及作用通路进行了探索研究。在NADPH氧化酶的定量检测中,我们发现apocynin能够明显抑制NOX的活性;在细胞内活性氧的检测中,我们发现apocynin的干预降低了细胞内ROS的水平,同时我们还对p53随细胞内ROS的水平变化的表达在mRNA水平和蛋白水平进行了检测,发现细胞内ROS水平的改变与p53的表达成正相关。
　　2)接下来我们选用了SAMP6小鼠模型使用apocynin进行了体内的干预。小鼠自3个月大时开始接受小分子化合物的腹腔注射,在注射3个月后进行取材分析。Micro-CT结果显示apocynin明显改善了骨密度及骨小梁含量;Trap-Alp组织切片染色显示apocynin干预后,成骨细胞明显增多,而破骨细胞水平没有影响。
　　3)对SAMP6小鼠的BMSCs取材进行分析,SA-β–gal染色显示随着细胞传代数的增加,apocynin干预组的细胞衰老速度要低于DMSO对照组;RT-PCR结果显示,与DMSO组相比,apocynin组的p53表达减少,Oct-4表达增加;细胞增殖能力的实验结果同时表明,apocynin干预组的细胞具有更强的增殖能力;进行分化诱导后的ALP活性定量检测结果显示实验组具有更高的ALP活性。
　　3.结论
　　1)Apocynin、baxchannelblocker、iso-Olomoucine、(±)bayk8644四种小分子化合物对骨衰老过程中骨髓间充质干细胞的衰老进程有着明显的延缓或逆转作用。四种小分子化合物均能够在细胞水平改善衰老相关基因的表达,细胞的增殖、骨向分化等方面均产生了相关的改善现象。对这四种小分子化合物的进一步探索对研究干细胞治疗骨质疏松等骨衰老疾病具有重要的意义与广泛的研究前景。
　　2)Apocynin能够通过下调NOX的表达来改变细胞内活性氧的水平,从而直接影响到p53的表达,从而激活p53下游的一系列分子应答机制,改善细胞的衰老状态,增加了细胞的增殖能力和分化潜能。使用apocynin进行体内干预则能够明显改善SAMP6小鼠的骨质疏松进程,明显地增加了其骨量和骨密度。
　　综上所述,对骨衰老过程中影响到骨髓间充质干细胞衰老进程的小分子化合物的研究确定了几种能够对干细胞衰老产生明显作用的小分子化合物,这些小分子化合物在骨质疏松等骨衰老疾病的药物治疗中具有明显的研究潜力,为干细胞治疗骨质疏松提供了新的解决思路。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

1概述

2骨质疏松

3 BMSCs与骨质疏松

4小分子化合物在骨质疏松治疗中的研究

正文

第一部分 小分子化合物的筛选

实验一 抗BMSCs衰老的小分子化合物的种类和浓度的初步筛选

实验二 不同小分子化合物对BMSCs衰老关键靶基因作用能力的对照研究

第二部分 小分子化合物对Aging-BMSCs的细胞行为学的影响

实验一 小分子化合物对Aging-BMSCs衰老进程的影响

实验二 小分子化合物对Aging-BMSCs骨向分化的影响

第三部分 Apocynin的作用分子机制及其体内应用效果的研究

实验一 Apocynin在BMSCs衰老进程中所发挥的作用研究

实验二 Apocynin延缓BMSCs衰老进程的分子机制研究

实验三 Apocynin防治骨衰老的动物体内验证研究

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢