肾功能不全小鼠心肌缺血/再灌注损伤加重及机制：心肌脂联素信号通路受损

摘要

研究背景:
　　慢性肾脏疾病是世界性的大众健康问题,其与心血管疾病的发病率和死亡率升高密切相关。慢性肾脏疾病并发心血管疾病的危害日趋严重。慢性肾脏病患者心肌梗死的发生率是正常人的2倍。所以,防治慢性肾脏疾病对心血管系统的损伤是必须解决的首要课题。
　　脂联素是一种脂肪来源的30kDa细胞因子,具有降低炎症反应、促进能量代谢、以及保护心血管的作用。脂联素在血液中主要存在形式有:脂联素三聚体、全长脂联素、高分子量脂联素。在常见疾病如:高血压、冠心病等中,血清脂联素水平较低。以往研究证实:MI/R后脂联素水平下降,且脂联素通过减轻氧化/硝化应激保护I/R心肌。然而,慢性肾功能不全患者血浆脂联素水平升高,肾功能不全伴发的心血管并发症的发病率和死亡率也明显升高。到目前为止,脂联素对慢性肾脏疾病并发心血管疾病的作用及机制没有阐明。
　　研究目的:
　　⒈观察肾功能不全小鼠动物模型血、尿脂联素的动态变化及I/R对肾功能不全小鼠心肌的作用。
　　⒉阐明脂联素对肾功能不全小鼠I/R心肌的作用及机制。
　　研究方法:
　　⒈肾功能不全模型的建立:动物麻醉后,切除左侧2/3肾脏。完整保留肾上腺,将剩余的肾脏组织送回腹腔。动物恢复2周后再次麻醉,完整切除右侧肾脏。
　　⒉小鼠心肌缺血再灌注模型的建立:小鼠经2％异氟烷麻醉后,用活结丝线结扎小鼠冠状动脉的前降支血管。30分钟后解开活结,心肌再灌注3小时(心肌凋亡检测)或24小时(心功能检测)。小鼠心肌缺血再灌注后,用预先置入的丝线再次结扎前降支,然后将2%伊文氏蓝注入小鼠左心室。
　　⒊外源性补充脂联素方法:野生型小鼠和脂联素敲除鼠部分肾切除术后立即给予随机腹腔注射PBS或gAd(globular adiponectin,gAd)2μg/g,1次/天,连续7天。
　　⒋生化检验:ELISA法检测肾功能不全小鼠的血、尿脂联素。第四军医大学西京医院检验科检验部分肾切除术后的血肌酐、尿肌酐、尿素氮、胱抑素、肌酐清除率和尿蛋白。
　　⒌心功能、心肌梗死面积和心肌凋亡的检测:再灌注24小时后,小动物超声检测心功能。TTC/伊文氏蓝双染检测心肌梗死面积。TUNEL染色和caspase-3活性检测评价心肌细胞凋亡。
　　⒍NO、硝基酪氨酸、超氧化物的检测:NO用硝酸还原酶法检测,硝基酪氨酸用ELISA法检测,超氧化物用光泽精法检测,DHE染色观察心肌超氧化物。
　　⒎Western blot检测:Western blot检测心肌中的eNOS、peNOS、iNOS、AdipoR1、AdipoR2、pAMPK和AMPK。
　　⒏免疫组化:免疫组化观察肾脏的脂联素及心肌中硝基酪氨酸。
　　研究结果:
　　⒈成功建立肾功能不全模型:5/6肾切除术后,血浆肌酐、尿素氮、胱抑素、尿蛋白升高,肌酐清除率下降。提示成功建立了肾功能不全模型。
　　⒉肾功能不全小鼠血、尿脂联素水平升高,肾脏脂联素减少:肾切除后术后24小时血脂联素开始降低,72小时达最低。1周后血浆脂联素逐渐升高,直至升高至4周。肾切除术后尿脂联素持续升高,肾脏脂联素减少。
　　⒊肾功能不全小鼠MI/R损伤增加:与WT假手术小鼠MI/R后相比,肾功能不全WT小鼠MI/R后心功能降低,心肌梗死面积增加,心肌凋亡增加。
　　⒋肾功能不全APN-KO小鼠MI/R损伤明显增加:与肾功能不全WT小鼠MI/R后相比,肾功能不全 APN-KO小鼠 MI/R后心功能明显降低,心肌梗死面积明显增加,心肌细胞凋亡明显增加。脂联素治疗的肾功能不全 WT小鼠和肾功能不全APN-KO小鼠心功能改善、心肌梗死面积减少、心肌细胞凋亡减少。
　　⒌肾功能不全小鼠上调心肌中iNOS的表达,增加NO的产生:肾功能不全WT小鼠心肌中NO增加,肾功能不全APN-KO小鼠心肌中NO明显增加。究其原因在于:心肌中iNOS的表达上调,peNOS表达减少。脂联素治疗后生成减少。
　　⒍肾功能不全小鼠心肌中O2-和硝基酪氨酸增加,脂联素治疗后减少:肾功能不全WT小鼠心肌中O2-和硝基酪氨酸增加,肾功能不全APN-KO小鼠心肌中O2-和硝基酪氨酸明显增加,脂联素治疗后减少。
　　⒎肾功能不全小鼠心肌中脂联素受体表达的变化:肾功能不全 WT小鼠心肌中AdipoR1和pAMPK表达减少,肾功能不全APN-KO小鼠心肌中AdipoR1和pAMPK表达明显减少,脂联素治疗后逆转。AdipoR2表达没有变化。
　　结论:
　　⒈慢性肾功能不全心肌I/R损伤敏感性增加与APN/AdipoR1/AMPK信号通路的下调和心肌氧化/硝化应激增加有关。
　　⒉补充的外源性脂联素对肾功能不全心肌具有保护作用。

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封面

声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一 慢性肾脏疾病对心血管系统的影响

二 脂联素对心血管保护作用的研究进展

三 脂联素与慢性肾脏疾病关系的研究进展

四 血浆脂联素与脂联素受体的研究进展

正文

实验一 建立肾功能不全小鼠动物模型

1 材料

2.方法

3.结果

4.讨论

实验二 肾功能不全小鼠脂联素动态变化

1.材料

2.方法

3.结果

4讨论

实验三 脂联素对肾功能不全小鼠心肌保护作用的研究

1.材料

2.方法

3结果

4.讨论

实验四 脂联素对肾功能不全小鼠心肌的保护作用机制研究

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢