Wnt信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜共培养体系成软骨响应中作用的研究

摘要

良好的弹性及较低的摩擦性能是关节软骨的主要力学特性,因此它在关节的功能活动中极其重要。在人类和哺乳动物中,关节的损伤是极其常见的,由于关节软骨缺乏直接血管供应及神经支配,其损伤后难以自行修复。因此,需要我们去找到一种可行方法来治疗损伤后的软骨。临床上用于软骨修复的方法较多,但都有一定的不足,组织工程软骨的出现为软骨再生提供了新的治疗方法。组织工程软骨的构建需要三大基石:即种子细胞、支架材料和生长因子。骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其来源广泛、易于培养且具有多向分化潜能而成为组织工程技术中重要的种子细胞,用其作为种子细胞来进行组织工程软骨的构建已成为现实。生长因子能够诱导组织工程软骨种子细胞向软骨方向分化,并且能够促进种子细胞的生长。生长因子主要包括:胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGF-1),成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)及转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)等,而富血小板纤维蛋白(platelet-richfibrin,PRF)因其含有多种天然比例的复合生长因子、取材方便、制备简单、无免疫排斥等优点正被先后用于组织缺损的修复,本课题组前期研究发现PRF能够缓慢释放多种生长因子,并成功的利用PRF与细胞膜片复合构建组织工程软骨用于修复缺损的软骨组织,取得了很好的修复效果。组织工程软骨的构建除了需要种子细胞、生长因子及支架材料以外还取决于生物化学和力学效应的共同作用,文献报道力学刺激能够增强BMSCs向软骨细胞分化的能力,但其机制不明。本系列研究前期发现120KPa、1h/d、连续4d的静态液压加载能够显著促进BMSCs向软骨方向分化,但是关于BMSCs/PRF共培养体系在力学作用下成软骨的分子机制目前还在探索研究之中。Wnt信号通路包括经典Wnt信号通路与非经典Wnt信号通路,非经典和经典的Wnt信号通路在细胞向软骨分化的过程起着重要的作用。研究表明Wnt/β-catenin信号通路在阻止软骨的分化,加强软骨的成骨和推动软骨的成熟中是有意义的,而非经典的Wnt信号通路通过Wnt5a的介导作用推动软骨的分化,推迟软骨从成熟到肥大的阶段。然而Wnt信号通路是否参与BMSCs在力学刺激成软骨的过程我们尚不清楚,压力与PRF是否对Wnt信号通路有作用我们还不是很明确,以及经典与非经典Wnt信号通路在成软骨之间的关系还没有见到相关报道。因此,本研究将采用WesternBlot、Real-timePCR方法深入探讨Wnt信号通路在压力促BMSCs细胞膜片及BMSCs/PRF双膜共培养体系向成软骨方向分化中扮演的角色,以及经典与非经典Wnt信号通路在压力促BMSCs成软骨过程中各自所起的作用及其相互关系
　　本实验共分为四个部分:
　　实验一,我们选用4月龄新西兰大白兔,在其髂骨处抽取骨髓,采用密度梯度离心法获取BMSCs,培养至P3代,经表面标记物的鉴定及成脂成骨诱导后证明所得到的细胞是具有多向分化潜能的BMSCs;经膜片诱导液诱导后制得BMSCs细胞膜片,在同体兔耳缘中动脉抽取10ml动脉血,经3000r/min快速离心10min后制得PRF,将PRF压制成膜后置于BMSCs膜片上制成双膜共培养体。
　　实验二,我们选用课题组前期筛选出的能够显著促进BMSCs体内外成软骨效应的120KPa静态压力作用于单独培养或与PRF共培养的BMSCs细胞膜片,通过WesternBlot方法观察0-60min中压力作用于单独培养或与PRF共培养的BMSCs细胞膜片后经典Wnt/β-catenin信号通路与非经典Wnt/ca2+信号通路的激活情况。结果显示,当120KPa的压力作用于单独BMSCs膜片15min后激活BMSCs中经典的Wnt/β-catenin信号通路p-GSK3β蛋白的表达,30min时激活BMSCs中经典的Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的表达,60min时两种蛋白的表达量达到最大。当120KPa的压力作用于与PRF共培养的BMSCs膜片时,经典Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达未发生明显的变化。当120KPa的压力作用于单独BMSCs膜片30min后激活BMSCs中非经典的Wnt/Ca2+信号通路,且在60min非经典Wnt/Ca2+信号通路相关蛋白的表达量最大,当120KPa的压力作用于与PRF共培养的BMSCs膜片时非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达量提高;说明120KPa的压力能够激活单独或与PRF共培养的BMSCs膜片中经典与非经典的Wnt信号通路;且与PRF共培养的BMSCs膜片中非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达量高于单独的BMSCs膜片。
　　实验三,观察经典Wnt/β-catenin信号通路与非经典Wnt/Ca2+信号通路在成软骨中的作用。经典Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939选1μM、2μM、4μM三个浓度,非经典Wnt/Ca2+信号通路抑制剂L-690,330选用20μM、50μM、100μM三个浓度,经典Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939在压力作用前16h加入膜片培养液中,非经典Wnt/Ca2+信号通路抑制剂L-690,330在压力作用前5d加入膜片培养液中,120KPa作用60min后提取BMSCs膜片中的蛋白与mRNA,WesternBlot方法检测经典与非经典信号通路的特异性指标的表达,以确定不同抑制剂浓度对两条信号通路的抑制作用;Real-timePCR检测PCNA基因的表达以监测不同浓度抑制剂对细胞增殖活性的影响。结果表明2μMXAV939可显著抑制细胞膜片中经典Wnt信号通路,且不影响细胞的增殖活性;50μML-690,330可显著抑制细胞膜片中非经典Wnt信号通路,且不影响细胞的增殖活性。将实验二所筛选的最适压力条件(120KPa、60min)作为该细胞力学刺激条件,利用实验三筛选的抑制剂浓度将实验分为4组:BMSCs/PRF双膜共培养组,BMSCs/PRF双膜共培养+压力刺激组,Wnt/β-catenin信号通路或Wnt/ca2+信号通路抑制剂预处理的BMSCs/PRF双膜共培养组,Wnt/β-catenin信号通路或Wnt/ca2+信号通路抑制剂预处理的BMSCs/PRF双膜共培养+压力刺激组,WesternBlot方法及Real-timePCR方法检测非经典Wnt/Ca2+通路及经典Wnt/β-catenin通路信号分子与特异性成软骨指标的表达,结果发现在加入2μM的XAV939抑制剂后软骨相关指标Sox-9、Aggrecan及Ⅱ型胶原(collagentypetwo,Col-Ⅱ)的蛋白水平及基因表达降低,说明经典Wnt/β-catenin信号通路正向调控压力促BMSCs/PRF双膜共培养体系中干细胞的软骨向分化过程;加入50μM的L-690,330抑制剂后软骨相关指标Sox-9、Aggrecan及Ⅱ型胶原的蛋白水平及基因表达升高,说明非经典Wnt/Ca2+信号通路也参与了压力促BMSCs/PRF双膜共培养体中干细胞的软骨向分化的过程,但起着负向调控作用。
　　实验四,观察经典Wnt/β-catenin信号通路与非经典Wnt/Ca2+信号通路两者之间的相互关系。我们通过在BMSCs细胞膜片中加入2μM经典Wnt信号通路的抑制剂XVA939并经120KPa的静态液压力学加载装置作用60min后,WesternBlot方法检测非经典Wnt/Ca2+信号通路分子活化情况,结果发现该信号通路中CaMKⅡ与PKC活化明显增强,同理,当我们加入非经典Wnt/Ca2+信号通路抑制剂后来观察经典Wnt/β-catenin通路分子活化情况,发现β-catenin信号分子表达增强,说明在压力促BMSCs/PRF共培养体系中干细胞成软骨向分化过程中经典与非经典Wnt信号通路之间存在相互抑制关系。
　　实验结论:无论BMSCs膜片单独培养或与PRF共培养状态下,120KPa、60min的静态液压均能够有效激活BMSCs中的Wnt/β-catenin信号通路与非经典Wnt/Ca2+信号通路,其中与PRF共培养时压力对BMSCs中非经典的Wnt信号通路的激活作用更加明显,但PRF存在与否对压力激活BMSCs中经典Wnt信号通路分子的效应不产生明显影响。2μMXAV939浓度可明显抑制BMSCs膜片中的经典Wnt信号通路分子的表达且不影响细胞的增殖活性、50μML-690,330则能有效抑制BMSCs细胞膜片中的非经典Wnt信号通路且不影响细胞的增殖活性。进而采用逆向阻断的方法发现,经典的Wnt/β-catenin信号通路参与了压力促BMSCs软骨向分化的过程并且起到正向调控作用,而非经典Wnt/Ca2+信号通路也参与了压力促BMSCs软骨向分化的过程但起到负向调控作用。并且本研究证实经典的Wnt/β-catenin信号通路与非经典Wnt/Ca2+信号通路之间存在相互抑制的关系。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、组织工程软骨的构建

二、Wnt信号通路

正文

实验一 兔BMSCs体外培养及BMSCs/PRF双膜共培养体系的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 压力对与PRF共培养体系中BMSCs的Wnt信号通路的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 Wnt信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜共培养体系成软骨响应中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 Wnt/Ca2+与Wnt/β-catenin信号通路在压力调控BMSCs/PRF双膜共培养体系成软骨响应过程中的相互作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢