CTR1和ATP7A参与铅诱导血-脑脊液屏障铜蓄积的机制研究

摘要

铅是常见的环境重金属污染物,具有显著的神经毒性。近年来研究证实:铅在某些神经退行性疾病(如PD、AD等)的发生、发展过程中起到重要作用,其机制可能与诱导细胞氧化应激、扰乱神经递质的释放及其受体的表达和功能、扰乱细胞能量代谢等有关。因此深入研究铅暴露产生的神经毒性,阐明其作用机制,探讨可能的防治措施,是预防医学亟待解决的重大课题。
　　诱导氧化应激反应是铅神经毒性的重要机制之一。但是铅离子本身并不具有强氧化性,因此我们推测铅所诱导的氧化应激反应可能是一种间接作用。铜是人体必需的微量元素,但是,细胞中过量的铜可以导致细胞氧化应激反应的增强,从而在多种神经退行性疾病的发生和发展过程中起到重要的促进作用。血脑脊液屏障(Blood-cerebrospinalfluidbarrier,BCB)分隔血液和脑脊液,限制其间的物质转运,对维持大脑中铜的内环境平衡也起到关键作用。以往研究表明,铅暴露可以改变大脑铜离子内环境平衡,引起神经细胞铜的蓄积。细胞铜的代谢主要由铜转运体调控,包括铜转运体1(coppertransporter1,CTR1)、二价金属转运体1(divalentmetaltransporter1,DMT1)、抗氧化蛋白1(antioxidant1copperchaperone,ATOX1)和铜转运ATP酶(如ATP7A、ATP7B)等,上述铜转运体蛋白在脉络丛上皮细胞中均有表达。近年来,国内外许多学者就铜离子内环境失衡所致毒性效应的机制进行了大量研究,但其确切的机制仍不十分明确。
　　综上所述,我们推测铅暴露可能通过改变这些铜转运体的表达,扰乱中枢神经系统中铜的内环境平衡。本研究以SD大鼠和大鼠脉络丛上皮细胞系Z310为实验对象,探讨CTR1、ATP7A等铜转运体在铅诱导脉络丛上皮细胞铜蓄积中的作用,以及铜失衡在铅诱导的细胞氧化应激中的作用。本研究将为阐明铅暴露导致大脑铜离子代谢紊乱及氧化应激损伤的分子机制提供研究基础。
　　目的:
　　本研究通过建立慢性铅暴露大鼠模型和脉络丛上皮细胞系Z310模型,研究铅暴露改变BCB中铜内环境平衡的机制,探讨CTR1、ATP7A等铜转运体在铅诱导脉络丛上皮细胞铜蓄积中的作用,以及铜失衡在铅诱导的细胞氧化应激中的作用。本研究将为阐明铅暴露导致大脑铜离子代谢紊乱及氧化应激损伤的分子机制提供研究基础。
　　方法:
　　1.建立动物模型和细胞模型
　　1)动物模型:将21日龄SD大鼠随机分为室温对照组(16只)和铅暴露组(16只),参考前期实验和文献报道确定染毒剂量为100ppmPb(AC)2;染毒方法为饮水法。
　　2)细胞模型:大鼠脉络丛上皮细胞系Z310,MTT法筛选铅染毒剂量,根据结果我们在后续的实验中选择0、2.5、5、10μmol/L作为铅暴露的浓度。
　　2.采用原子吸收分光光度法检测铅暴露大鼠血液、脑脊液、大脑组织中铅、铜的含量;采用放射性同位素吸收实验Gamma计数法检测铅暴露对Z310细胞铜吸收的影响。
　　3.采用总SOD活性检测试剂盒和MDA检测试剂盒,检测铅对细胞SOD活性和MDA含量的影响。
　　4.采用免疫荧光染色法检测脉络丛组织中CTR1、ATP7A的表达水平;用Westernblot、qRT-PCR等方法检测铅暴露对细胞CTR1、ATP7A等铜转运体表达水平的影响。
　　5.采用siRNA干涉技术和抑制剂对细胞进行处理,分别过表达和阻断铜转运相关蛋白的表达,观察对细胞内铜蓄积量的影响。
　　6.采用已构建的Tet-可诱导CTR1高表达细胞系(iZCTR1),检测细胞内铜水平升高对细胞中铜转运体ATP7A表达水平的影响。
　　结果:
　　1.慢性铅暴露对大鼠大脑中铜含量和氧化应激水平的影响
　　铅暴露后,与对照组相比,大鼠大脑(海马、皮质、纹状体、脑脊液)中铜含量显著升高(p<0.01),并且大鼠大脑中氧化应激水平增高,表现为T-SOD活力显著下降,MDA含量显著增高(p<0.01)。
　　2.慢性铅暴露对脉络丛中铜转运体表达的影响
　　脉络丛免疫荧光染色结果发现CTR1的荧光表达量显著增多,而ATP7A的表达量是显著下降的。
　　3.铅暴露导致Z310细胞内铜蓄积
　　与对照组相比,Z310细胞铅处理24h后,细胞内的铜吸收量显著增加;细胞铜吸收后,再加入铅处理24h,铅处理组细胞中铜的水平显著高于对照组(p<0.01)。
　　4.铅、铜暴露对Z310细胞内氧化应激水平的影响
　　单独铅暴露(5μmol/LPb(AC)2)和铜暴露(5μmol/LCuCl2)24h均引起T-SOD的活力下降,铅、铜联合处理组T-SOD活力下降的幅度均显著大于铅或铜单独暴露组(p<0.01);单独铅暴露和铜暴露24h均引起MDA含量增高;铅、铜联合处理组MDA含量增加的幅度均显著大于铅或铜单独暴露组(p<0.01)。
　　5.铜转运体在铅暴露所致铜蓄积中的作用
　　与对照相比,铅暴露后,CTR1的表达水平增高,ATP7A的表达水平下降,并具有剂量依赖性。CTR1siRNA干涉可以显著抑制Z310细胞对铜的吸收,并且阻断了铅诱导的细胞铜吸收增加;ATP7AsiRNA干涉可以显著抑制Z310细胞对铜的排出(p<0.01)。
　　6.细胞内铜含量对铜转运体的反馈调节
　　Z310细胞不同浓度(5,25和50μmol/LCuCl2)铜暴露24h后,细胞内铜水平增高,CTR1的蛋白水平有明显下降,而mRNA水平没有明显改变;ATP7A的蛋白水平和mRNA水平都没有明显变化。在iZCTR1细胞中,铜处理的细胞内铜蓄积对ATP7A的表达水平并未产生显著影响,而铅处理可导致细胞中ATP7A的表达水平出现显著降低(p<0.01)。
　　结论:
　　1.铅暴露可导致动物大脑组织和Z310细胞中铜水平的增高,而铜离子平衡的紊乱可能导致氧化应激反应的增强。
　　2.铅暴露导致的细胞中铜蓄积可能是通过两种途径:一是铅暴露上调CTR1表达,吸收更多的铜进入细胞;二是铅暴露下调ATP7A表达,抑制了铜的运输功能,引起细胞中铜流出的减少。
　　3.细胞内铜水平的增加对CTR1的表达产生负反馈,对ATP7A的表达未产生显著影响。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 铅的神经毒性

2 铅对BBB与BCB的影响

3 铜的理化特性及转运机制

正文

第一部分 铅暴露大鼠模型的建立及其对大脑铜代谢的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 铅诱导脉络丛上皮细胞铜蓄积的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 细胞铜水平对CTR1和ATP7A表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

致谢