子宫内膜炎患牛子宫中MMPs的表达及其调控机制

摘要

子宫内膜细胞外基质对子宫生物学功能的维持非常重要，当子宫患有疾病时子宫内膜的细胞外基质表达出现改变，除了与卵巢激素相关外，还受基质金属蛋白酶(MMPs)的调节。为了揭示MMPs与奶牛子宫内膜炎的关系和细胞水平调控机制，本试验采集患子宫内膜炎的和未配种健康的奶牛子宫，观察奶牛子宫组织形态学变化，分别用RT-PCR检测该组织中MMP-2、MMP-9和NF-κB的mRNA水平，用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的酶活性。取未配种健康奶牛子宫内膜，用植块法培养奶牛子宫内膜上皮细胞，纯化传至3-5代，将处于对数期的细胞随机分为5组:空白对照组、1.0μg·ml-1 LPS组、2.0μg·ml-1 LPS组、3.0μg·ml-1LPS组和PDTC抑制组，每组3个重复，培养48h后，提取总RNA和膜蛋白，分别用RT-PCR法和明胶酶谱法检测TNF-α、MMP-2、MMP-9和NF-κB mRNA的表达，以及MMP-2和MMP-9的酶活性。试验结果如下: 1.子宫内膜炎患牛子宫内膜上皮细胞排列不整齐，粘膜下细胞基质疏松、有炎性细胞浸润。 2.子宫内膜炎患牛子宫组织中MMP-2、MMP-9 mRNA的表达和酶活性与对照组相比差异显著(P＜0.05);炎症时NF-κB mRNA含量与对照组相比差异显著(P＜0.05)。子宫内膜炎患牛子宫组织NF-κB与MMPs变化一致，说明MMP-2和MMP-9参与牛子宫内膜炎症过程，牛子宫组织中MMP-2和MMP-9的增多可能与NF-κB增多有关。 3.用LPS刺激体外培养的子宫内膜上皮细胞，TNF-α升高、细胞形态出现明显改变，表明本试验成功建立子宫内膜上皮细胞炎症模型。 4.1.0μg·ml-1 LPS组MMP-2、MMP-9和NF-κB较空白对照组显著增加;2.0μg·ml-1LPS组和3.0μg·ml-1 LPS组MMP-2、MMP-9和NF-κB较空白对照组极显著增加。说明在体外培养的牛子宫内膜上皮细胞发生炎症时，MMP-2和MMP-9增多，且随LPS浓度的升高MMPs表达增加，MMP-2和MMP-9的表达可能与NF-κB相关。 5.牛子宫内膜上皮细胞先加PDTC再用1.0μg·ml-1LPS刺激，MMP-2和MMP-9的表达与对照组相比显著减少，而NF-κB的表达与对照组相比无明显差异，说明PDTC没有减少NF-κB的表达，但可以抑制NF-κB指导蛋白的表达，使MMPs含量减少。 上述体内和体外试验结果表明，MMP-2和MMP-9参与奶牛子宫内膜炎的发生，且可能受NF-κB信号通路的调控。

目录

声明

摘要

前言

文献综述

1 奶牛子宫内膜炎的发病机制

2 奶牛子宫内膜炎发生的标志性细胞因子——TNF-α

2．1 TNF-α与炎症局部的先天免疫应答

2．2 TNF-α与奶牛子宫内膜局部先天免疫反应

3 基质金属蛋白酶与奶牛子宫内膜炎的关系

3．1 基质金属蛋白酶的来源、分类和基本功能

3．2 MMP-2和MMP-9与炎症的关系

3．3 MMP-2和MMP-9与奶牛子宫内膜炎的关系

4 脂多糖诱导细胞炎症的信号通路

4．1 脂多糖

4．2 脂多糖结合蛋白

4．3 白细胞分化抗原14

4．4 Toll样受体4

4．5 髓样分化蛋白

4．6 核转录因子κB

4．7 LPS-NF-κB信号通路

5 MMPs对奶牛子宫内膜炎的分子调控机制

6 课题研究的目的与意义

试验一 子宫内膜炎患牛子宫组织MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的表达

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 主要试剂及试剂盒

1．3 主要仪器

1．4 试验试剂配制

2 试验方法

2．1 奶牛子宫内膜上皮组织病理形态学观察

2．2 奶牛子宫内膜组织总RNA的提取及cDNA的合成

2．3 引物合成

2．4 RT-PCR法检测子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9和NF-κB p65 mRNA的表达量

2．5 奶牛子宫内膜组织胞膜蛋白的提取

2．6 明胶酶谱法检测奶牛子宫内膜组织中MMP-2和MMP-9的酶活性

2．7 数据处理

3 结果

3．1 子宫内膜炎患牛子宫的组织形态学观察

3．2 奶牛子宫内膜上皮组织总RNA的品质鉴定

3．3 奶牛子宫内膜组织中MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的基因鉴定

3．4 奶牛子宫内膜组织中MMP-2和MMP-9的酶活性鉴定

4 讨论

4．1 奶牛子宫内膜组织MMP-2和MMP-9的表达

4．2 奶牛子宫内膜组织MMP-2、MMP-9对子宫内膜炎的作用机制

4．3 奶牛子宫内膜组织MMP-2、MMP-9表达的信号调控机制

试验二 LPS体外诱导子宫内膜上皮细胞MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的表达

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 主要试剂及试剂盒

1．3 主要仪器

2 试验方法

2．1 奶牛子宫内膜上皮细胞的体外分离培养

2．2 细胞的纯化与传代

2．3 奶牛子宫内膜上皮细胞炎症模型的建立

2．4 PDTC处理空白对照组细胞

2．5 奶牛子宫内膜上皮细胞中MMP-2、MMP-9及NF-κB p65 mRNA表达

2．6 奶牛子宫内膜上皮细胞中MMP-2、MMP-9的酶活性

2．7 数据处理

3 结果

3．1 各组奶牛子宫内膜细胞形态学特征

3．2 奶牛子宫内膜上皮细胞总RNA的品质鉴定

3．3 LPS刺激组细胞中TNF-a的基因表达

3．4 奶牛子宫内膜上皮细胞MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的基因表达

3．5 奶牛子宫内膜上皮细胞MMP-2和MMP-9的酶活性

3．6 PDTC对奶牛子宫内膜上皮细胞表达MMP-2、MMP-9和NF-κB p65的影响

4 讨论

4．1 奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养

4．2 TNF-α在炎症过程中表达的应用

4．3 奶牛子宫内膜上皮细胞中NF-κB对MMP-2、MMP-9的调控

结论

参考文献

英文缩写词表

致谢

硕士在读期间发表的论文