DprA蛋白在肺炎链球菌毒力中的作用研究

摘要

肺炎链球菌性疾病（pneumococcal disease）是全球重要的公共卫生问题之一，近年来，由于肺炎链球菌耐药的快速发展和疫苗免疫逃逸的出现，使深入研究肺炎链球菌的致病机制，发掘新的治疗靶点变得越来越重要。
　　DprA（DNA processing protein）是肺炎链球菌自然转化的关键蛋白，在自然转化过程中，可以与细菌感受态摄取的外源DNA结合，保护摄入的DNA不被降解，并完成DNA向重组酶的呈递，同时，DprA还可以通过抑制感受态形成的关键蛋白ComE的功能，使感受态迅速关闭，细菌恢复到常规状态。由于“感受态”对肺炎链球菌的生理和毒力将产生不利影响，所以，DprA可能通过关闭感受态的方式参与细菌的生理和毒力调节；而且，感受态向常规状态的转化涉及了大量基因的表达变化，那么，关闭感受态的关键蛋白DprA也可能通过影响其中某些基因的表达而参与肺炎链球菌的生理和毒力调节；同时，在预实验中构建了dprA插入突变株，实验表明，突变株黏附肺上皮细胞株A549的能力减弱，并缺失了一个胆碱结合蛋白组分，而胆碱结合蛋白本身就是细菌的毒力因子，实验结果也提示DprA可能参与了肺炎链球菌的毒力形成。
　　在此基础上，本研究将进一步研究DprA对肺炎链球菌生物学特性的影响，鉴定DprA在毒力方面的作用，并探讨其参与毒力形成的机制。
　　由于DprA的RF（Rossmannfold）结构域（位于DprA C端）是发挥DNA呈递功能和感受态关闭功能的关键区域，所以，在实验中，利用肺炎链球菌的自然转化特性，以同源重组方式构建了DprA RF缺失突变株和DprA缺失突变后的回补株，并且，为了排除DprA缺失突变株中，插入抗生素筛选序列Janus cassette对菌株的影响，实验中还构建了在基因组相同位置插入Janus cassette且dprA完整的对照菌株。另外，便于在动物活体内观察到感染后细菌的分布和致病情况，还构建了DprA RF缺失突变的生物发光菌株。
　　上述相关菌株在液体培养基的生长曲线，以及聚苯乙烯表面的生物膜形成实验表明，DprA RF缺失后，菌株生长减慢，生物膜形成能力减低，证实细菌的生理受到影响；在细胞水平，肺炎链球菌与肺上皮细胞株A549相互作用的实验证实，缺失突变株黏附、侵袭 A549细胞的能力减弱；并且，在动物实验中进一步验证，接种dprA缺失突变株小鼠的死亡率下降，细菌在小鼠体内的繁殖减慢、播散受到限制，与野生株相比，更易被机体清除。综合上述结果，我们认为，DprA与肺炎链球菌的毒力密切相关，是肺炎链球菌的毒力相关因子。
　　最后，通过胆碱结合蛋白分析、蛋白电泳-质谱分析以及Western blot确认，证实 DprA RF缺失后，胆碱结合蛋白的组分之一胆碱结合蛋白 A（CbpA）表达明显减低，而CbpA是肺炎链球菌非常重要的黏附和侵袭因子，解释了在实验中观察到的毒力减低现象。
　　总之，构建了肺炎链球菌dprA缺失突变株、突变对照株和缺失后回补株，通过细菌水平、细胞水平和动物水平实验，首次证实了DprA是肺炎链球菌的毒力相关因子，而CbpA的表达减低是dprA缺失突变后毒力减低的原因。

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前言

文献回顾

1 肺炎链球菌性疾病的治疗和预防

2 肺炎链球菌的毒力因子

3 自然转化关键基因可能与细菌的生理和毒力相关

实验一 dprA突变株的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 DprA在肺炎链球菌生理和毒力中的功能验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 DprA参与肺炎链球菌毒力的机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢