肾综合征出血热患者血浆可溶性CD163与疾病严重程度相关性研究

摘要

肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus）感染引起的一种自然疫源性疾病，主要临床表现为短期发热、出血、低血压休克和肾脏损伤，典型病例具有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期临床经过。近半个世纪来全世界每年HFRS发病人数约10万，其中70％～90%的病例发生在中国，病死率约为1%～10%。HFRS的基本病理变化是全身小血管及毛细血管内皮炎症、功能障碍、免疫细胞浸润、通透性增加。然而，HFRS的发病机制至今尚未完全阐明。目前的观点认为，汉坦病毒引起的 HFRS是一个多因素参与的复杂的病理过程，主要是病毒直接作用损伤和继发性免疫损伤共同所致的结果。病毒感染引起机体的免疫损伤包括免疫复合物沉积、补体激活、T细胞的细胞免疫应答和B细胞的体液免疫应答、血小板功能障碍以及汉坦病毒感染诱导免疫细胞释放炎症因子等。
　　单核/巨噬细胞是机体抗病毒免疫的重要组成部分，在病毒感染后它可触发机体的免疫/炎症反应参与启动和直接的抗病毒效应，是机体固有免疫和适应性免疫的桥梁。在外周血中单核细胞是一群异质性细胞，根据单核细胞表面CD14及CD16的表达情况可分为3个亚群，经典单核细胞(CD14++CD16?，Mon1)、中间单核细胞(CD14++CD16+，Mon2)和非经典单核细胞(CD14+CD16++，Mon3)。Mon1占外周血单核细胞的80%～90%，Mon2和Mon3共占外周血单核细胞的10%～20%。在炎症刺激及自身分化的作用下外周血单核细胞各亚群的构成比例和功能处于动态变化中。
　　CD163是血红蛋白/珠蛋白清道夫受体，特异性地存在于单核/巨噬细胞表面。它最主要也是研究最多的功能是可特异性识别血红蛋白-珠蛋白复合体并与之结合后内吞，使血红蛋白转化为胆红素、亚铁离子及一氧化碳，进而避免了血红蛋白对机体的氧化损伤。CD163还能从单核细胞表面脱落至血循环中，成为可溶性 CD163（sCD163），发挥抗炎和免疫调节作用。
　　sCD163已在多种感染及炎症性疾病的相关研究中进行了测定和报道，例如，败血症、糖尿病、肺结核、肝脏疾病、获得性免疫缺陷综合征、登革热和风湿性关节炎。然而，在HFRS患者中单核细胞亚型CD163的表达水平及血浆sCD163水平的变化尚未见报道。因此，鉴于 CD163和sCD163在免疫应答中的重要作用，我们推测CD163和sCD163在HFRS病程中可能发生了明显变化，并与HFRS的发病机制有密切关系。为此，本研究拟观察HFRS患者外周血单核细胞亚型CD163的表达和血浆 sCD163的变化，进一步分析 CD163、sCD163与疾病严重程度的相关性，为HFRS发病机制和临床治疗研究提供资料。
　　病例和方法：
　　收集第四军医大学唐都医院2011年10月至2014年1月期间收治的81例HFRS患者及15例正常人的PBMC和血浆。根据患者的病历资料和HFRS诊断标准，将81名 HFRS患者划分为轻型（12例）、中型（21例）、重型（25例）、危重型（23例）4组，用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量检测不同病期和病型患者血浆 sCD163水平，并对血浆 sCD163水平的动态变化与病情有关的实验室参数的相关性进行了分析。进一步用流式细胞术对单核细胞亚型进行鉴定，并分析各亚型单核细胞表面CD163的表达变化。
　　结果：
　　1.HFRS患者血浆sCD163的水平
　　HFRS患者发热/低血压休克期、少尿期、多尿期、恢复期及健康对照血浆sCD163检测值的中位数（四分位数间距）分别为3.75（2.65-6.46）mg/L、3.58（2.17-4.28） mg/L、2.43（1.69-3.09）mg/L、1.80（1.43-2.38）mg/L和0.87（0.66-0.99）mg/L。与正常对照相比，患者急性期（包括发热期、低血压/休克期及少尿期）血浆sCD163水平明显升高（P＜0.0001），恢复期（多尿期、恢复期）下降，但仍高于正常对照组（P＜0.0001）。HFRS不同病型组患者血浆sCD163水平呈现出急性期升高、恢复期降低的相同趋势，尤其是重型/危重型组变化更为明显。在急性期29例轻型/中型患者血浆sCD163水平仅有4例（13.7%）超过4 mg/L，而46例重型/危重型患者血浆sCD163水平有28例（51.5%）例超过4 mg/L，是轻型/中型HFRS患者血浆sCD163水平的4.3倍。对HFRS患者血浆sCD163水平与指示HFRS患者病情严重程度的实验室参数和反应机体炎症程度的细胞因子进行相关性分析，发现升高的血浆sCD163与外周血血小板计数呈负相关（r=-0.6109，P＜0.0001），与白细胞计数（r=0.5322，P＜0.0001）、血肌酐水平（r=0.3718，P＜0.0001）、血尿素氮水平（r=0.38，P＜0.0001）、血浆IL-6水平（r=0.4837，P＜0.0001）、血浆IFN-γ水平（r=0.4929，P＜0.0001）呈显著正相关。
　　2. HFRS患者单核细胞亚群变化
　　根据FCS-A和SSC-A及单核细胞表面CD14、CD16表达水平，将单核细胞分为经典单核细胞(CD14++CD16-)，中间单核细(CD14++CD16+)和非经典单核细胞(CD14+CD16++)。与正常对照相比中间单核细胞（CD14++CD16+）的比例在急性期明显升高（P＜0.0001），然而，经典单核细胞（CD14++CD16-）与非经典单核细胞（CD14+CD16++）的比例在急性期明显下降（P＜0.0001）。在急性期三种单核细胞CD163的表达水平均升高，但是中间单核细胞升高最明显（P＜0.0001）。同时我们还发现血浆sCD163与中间单核细胞的比例(r=0.5779，P＜0.0001)及CD163在中间单核细胞的表达水平(r=0.6245，P＜0.0001)呈正相关。
　　结论：
　　HFRS患者病程中血浆sCD163水平明显升高，单核细胞亚型的比例及CD163在其上的表达也呈现明显改变，这些变化在HFRS患者急性期最明显。并与指示HFRS患者病情严重程度的实验室参数和反应机体炎症程度的细胞因子密切相关。提示HFRS患者血浆可溶性CD163水平与疾病严重性及疾病过程的变化有密切关系，可作为衡量 HFRS患者疾病严重性的一个新的标记物。该结果将有助于理解汉坦病毒感染人类后单核细胞介导的免疫反应及病理过程。

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前言

文献回顾

1. HFRS的病原学及流行病学特征

2. HFRS的发病机制

3．CD163

1 材料

1.1 主要仪器及耗材

1.2 主要试剂

1.3 主要溶液

1.4 研究对象

2 方法

2.1 外周血PBMC的分离

2.2 血浆sCD163的测定

2.3 血浆IL-6的测定

2.4 血浆IFN-γ的测定

2.5 流式细胞术单核细胞亚型的鉴定及CD163在其上的表达

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 HFRS 患者临床资料

3.2 HFRS 患者血浆sCD163水平的变化

3.3 HFRS患者血浆IFN-γ、IL-6水平的变化

3.4 HFRS患者血浆sCD163与临床参数的相关性分析

3.5 HFRS患者血浆sCD163与细胞因子的相关性分析

3.6 单核细胞亚型分布

3.7 各亚型单核细胞CD163的表达情况分析

3.8 sCD163与单核细胞频率相关性分析

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢