突触囊泡蛋白2A在颞叶癫痫海马区星形胶质细胞上的表达及功能研究

摘要

颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）是目前成人最常见的药物难治性癫痫，发病机制不清。致痫灶内反应性星型胶质胶质细胞增生、肥大可能参与了颞叶癫痫发生过程，深入研究致痫灶内星型胶质细胞功能可能为癫痫治疗带来的策略。
　　星形胶质细胞通过释放胶质递质可同步调节大量神经元活动，类似于神经递质的量子化释放，囊泡介导的胞吐过程是胶质递质释放的重要途径，需要一系列分泌相关蛋白的参与。突触囊泡蛋白2A(synaptic vesicle protein2A,SV2A)是脑内突触传递的重要正向调节蛋白，在囊泡胞吐和维持 Ca2+稳态方面发挥重要作用，目前研究发现新型抗癫痫药物左乙拉西坦有可能通过SV2A介导抗癫痫作用，提示SV2A在癫痫发生过程中扮演重要角色，前期我课题组预实验发现星型胶质细胞在病理状态下表达SV2A,藉此我们提出假设：反应性星型胶质细胞表达SV2A促进了局部神经回路兴奋性增高，继而介导慢性颞叶癫痫的形成。
　　目的:观察 SV2A在颞叶癫痫病人和动物模型海马中的表达特征，以及在星型胶质细胞上的表达特点和超微结构，进而在离体水平探讨 SV2A参与活化状态星形胶质细胞的促兴奋机制。
　　方法:免疫组化染色观察SV2A在颞叶癫痫患者海马区和颞叶皮质中的表达变化。建立大鼠锂-匹罗卡品模型，比较SE后24h、1w、4w、8w SV2A在海马各区的分布特点及其 mRNA和蛋白水平的变化。免疫荧光双标检测颞叶癫痫患者及动物模型 SE后上述时点海马星形胶质细胞上SV2A的表达特点，并通过免疫电镜对SE后4w星形胶质细胞上的 SV2A进行超微结构观察。LPS干预原代培养的星形胶质细胞以模拟其在硬化海马时的变化，于24h和48h后检测SV2A的蛋白表达及分布；单独给予星形胶质细胞胞内Ca2+动员剂ATP或联合LPS干预后12h、24h观察SV2A蛋白表达的变化；利用si-RNA干扰技术降低SV2A的表达后观察Ca2+感受器突触结合蛋白4（synaptotagmin4,Syt-4）mRNA的变化，以及LPS和LPS+ATP干预后Syt-4与SV2A mRNA水平的变化趋势。
　　结果:（1）TLE-HS患者海马区及颞叶皮质中阳性表达的 SV2A明显少于对照组（P<0.05）。动物模型急性期（SE后24h）、潜伏期（SE后1w）、慢性期早期（SE后4w）海马区SV2A mRNA和蛋白水平均低于对照组（P<0.05）；免疫组化显示SE后1w、4w时SV2A在CA3区透明层和DG门区的分布明显下降（P<0.05）。
　　（2）TLE-HS患者海马区AST上SV2A的阳性表达率明显高于对照组（P<0.05）。大鼠对照组及SE后24h海马AST上均未检测出SV2A的表达，而SE后1w时部分AST上已出现SV2A的表达，至SE后4w、8w时可见增生肥大的AST，硬化海马各区AST上均有SV2A的阳性表达；免疫电镜示对照组AST上极少出现SV2A的表达，但SE后4w硬化海马AST的胞浆及胶质丝上均有SV2A标记的银染颗粒。
　　（3）LPS活化AST24h、48h后SV2A蛋白表达明显增高（P＜0.05），免疫荧光显示AST胞浆及突起上均有SV2A的广泛分布；单独给予ATP干预不影响SV2A的蛋白表达，但联合LPS刺激24h后SV2A的蛋白表达明显升高（P＜0.05）。siRNA干扰AST SV2A的表达可降低Syt-4 mRNA水平（P＜0.05）；LPS单独或联合ATP干预后6h、12h、24h Syt-4与SV2A mRNA水平呈现一致性升高趋势。
　　结论: TLE患者海马和颞叶皮质标本中SV2A的表达降低，动物模型SE后各时点海马区同样发现了上述变化；SV2A的这种表达变化可能与SE后神经元凋亡和正常突触联系受损有关。人脑标本和动物模型慢性期硬化海马的AST上SV2A的表达异常增多，提示AST上的SV2A可能参与了癫痫发生的机制。ATP可升高活化状态下AST上SV2A的表达；AST中SV2A的变化影响了Ca2+依赖性谷氨酸释放通路关键分子Syt-4的表达。提示病理条件下AST中异常升高的SV2A可能通过调控Syt-4影响Ca2+依赖性谷氨酸递质的释放，进而参与癫痫发生中突触重塑的过程。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分 突触囊泡蛋白2A在颞叶癫痫患者及动物模型海马各区的表达特点

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

第二部分 颞叶癫痫发生中突触囊泡蛋白2A在星形胶质细胞的表达及超微结构

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

第三部分 突触囊泡蛋白2A参与活化状态星形胶质细胞谷氨酸释放的功能研究

1 引言

2 材料

3 方法

4 统计学分析

5 结果

6 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢