星形胶质细胞上酸敏感离子通道1a在颞叶癫痫发生中的作用研究

摘要

癫痫是神经系统第二大常见疾病，最突出的特点为发作的反复性、不可预知性和药物治疗的长期性。即使经系统规范化抗癫痫药物治疗，仍有接近1/3的患者癫痫发作未能得到有效控制，并最终进展成为难治性癫痫，给病人及家属带来了极大的痛苦，因此探索治愈癫痫的途径已成为神经病学领域的重要课题。目前癫痫的治疗药物主要靶向于控制发作症状，对慢性癫痫形成的病理生理过程难以发挥逆转作用，因此难以达到治愈癫痫的目的。这种情况下，探索新的针对癫痫发生的药物有可能为治愈癫痫带来希望。大量的动物实验和癫痫患者活检证据表明，星形胶质细胞的活化增生是癫痫发生中重要的病理改变。我们课题组前期研究发现：星形胶质细胞上的酸敏感离子通道1a（Acid Sensing Ion Channel1a，ASIC1a）在癫痫慢性期中表达增多，这种变化可能和癫痫慢性期的病理进展有关，提示星形胶质细胞上的ASIC1a可能参与癫痫发生的病理过程，并可能成为新的癫痫治疗靶点。
　　目的:
　　研究星形胶质细胞上ASIC1a在小鼠颞叶癫痫发生中的作用。
　　方法:
　　分别构建携带有星形胶质细胞特异性启动子GFAP的Asic1a基因sh-RNA及ORF（open reading frame）的重组腺相关病毒（recombined adeno-associated virus，rAAV）载体(rAAV-GFAP-GFP-ASIC1a-shRNA，rAAV-GFAP-ASIC1a-GFP)，经过立体定向注射感染海马星形胶质细胞，敲低野生（WT）型小鼠海马星形胶质细胞上 ASIC1a的表达，以及恢复Asic1a基因敲除（KO）小鼠海马星形胶质细胞上ASIC1a的表达。
　　使用雄性8周龄C57遗传背景的WT和Asic1a基因敲除型KO小鼠，采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射建立小鼠颞叶癫痫发生模型，在小鼠氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导癫痫持续状态后3-5天进行病毒载体立体定向注射和电极安装，观察小鼠癫痫持续状态发作后12-19天和5-6周4组实验小鼠：WT干扰组（下调ASIC1a表达）、WT对照组、KO型表达重建组（恢复ASIC1a表达）和KO型对照组脑电图发作和行为发作变化，结合免疫荧光染色方法进行分析。
　　结果:
　　1、小鼠海马经立体定向注射病毒后5周，超过90％的星形胶质细胞表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）。
　　2、小鼠氯化锂-匹罗卡品腹腔注射后12-19天（慢性癫痫发生潜伏期），敲低WT小鼠海马星型胶质细胞ASIC1a表达以及恢复ASIC1a KO小鼠海马星形胶质细胞上ASIC1a的表达对小鼠行为学发作以及 EEG癫痫样放电无明显影响。各组间潜伏期内发作次数、发作程度 Rac ine评分和平均自发发作持续时间均无统计学差异（P＞0.05）。WT干扰组和WT对照组脑电功率值无统计学差异（P＞0.05）；KO型表达重建组和KO型对照组脑电功率值无统计学差异（P＞0.05）；KO型表达重建组脑电功率值与WT型干扰组之间无统计学差异（P＞0.05）。
　　3、小鼠氯化锂-匹罗卡品腹腔注射后5-6周（慢性癫痫发生期），WT鼠海马星型胶质细胞ASIC1a敲低组慢性自发性癫痫发作次数以及发作间期EEG放电强度明显低于相应对照组（P＜0.05）。KO小鼠海马星形胶质细胞上ASIC1a表达重建组慢性自发性发作次数以及发作间期EEG放电强度较相应对照组明显增多（P＜0.05）。各组间行为发作等级和平均每次自发发作时间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论:
　　在小鼠颞叶癫痫发生模型中，特异性抑制星形胶质细胞上ASIC1a能够明显减少小鼠慢性自发性发作次数，并减轻脑电图发作强度，提示星形胶质细胞上的AS IC1a可能为癫痫发生治疗的新靶点。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 癫痫治疗现状

2. 癫痫发生概念的变化和它的重要性

3. 星形胶质细胞和癫痫

4. 酸敏感离子通道1a（ ASIC1a）

实验一 小鼠星形胶质细胞特异性启动子和ASIC1a基因的rAAV病毒载体包装与验证

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

实验二 星形胶质细胞上ASIC1a在癫痫发生中的作用研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢