太白银莲花皂苷6(saponin6)对胶质瘤U87细胞诱导凋亡的作用及其机制研究

摘要

神经胶质细胞瘤（简称胶质瘤）是一种源于神经组织外层间质细胞的恶性颅内肿瘤，较颅内其他类型的肿瘤多见，约占原发性颅内恶性脑肿瘤的70％，其中胶质母细胞瘤（GBM）恶性程度最高。由于 GBM存在侵袭性强，生长速度快，早期临床表现不典型等特性；即使患者积极地接受手术以及术后依据肿瘤恶性程度实施规范的放、化疗后，肿瘤复发率仍高居不下，病人往往预后不良，中位生存期约为14.6个月，3年存活率仅为10%。目前虽然有包括替莫唑胺（TMZ）、卡莫司汀（BCNU）等治疗药物，但是由于肿瘤细胞中多存在耐药蛋白以及自身DNA修复的异常，致使肿瘤对药物反应不佳；加之血-脑屏障、血-瘤屏障的存在以及细胞膜对药物的渗透能力的制约，新型药物的研发迫在眉睫。已有大量研究表明，中药提取物不同于传统化疗药物，可以选择性杀伤肿瘤细胞，对自身正常组织细胞影响较小。并且，药物常常通过多种细胞生长抑制途径等发挥功效，具有潜在的开发前景。
　　太白银莲花皂苷6（Saponin6 of Anemone taipaiensis，简称saponin6）单体提取自银莲花属植物太白银莲花。前期研究表明，某些太白银莲花提取物具有抑制胶质瘤生长的作用。不同于以往提取物的是，saponin6有效成分主要为齐墩果酸，C-3位寡糖链糖基数目少，同时C-28位含有游离羧基的特点，推断saponin6的生物活性较好。而目前尚无针对该药物的相关研究。因此，本次研究以 saponin6为研究对象，探究该药物在抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡过程中所发挥的作用以及可能存在的作用机制。实验主要分为三个部分：
　　第一部分：研究saponin6对胶质瘤U87细胞增殖的影响
　　【目的】：比较不同浓度saponin6对胶质瘤U87细胞增殖的影响；同时观察药物对正常小鼠海马神经元HT-22细胞的作用。
　　【方法】：
　　1.分别用0.00、1.60、3.20、6.40、12.80μg/mL的saponin6处理U87细胞24 h、48 h，对比相同浓度、作用时间的saponin6作用于正常小鼠海马神经元HT-22细胞，采用CCK8法检测saponin6对细胞活性影响；
　　2.通过流式细胞周期PI染色观察药物对细胞周期的影响；
　　3.利用SPSS20.0和GraphPad Prism5.01软件统计分析实验数据，计算IC50值。
　　【结果】：
　　1.与对照相比，saponin6处理后U87细胞活性抑制明显；随着作用时间与作用浓度增加，药物对细胞活性的抑制作用增强。在药物浓度达到2.53μg/mL时，50%的U87细胞增殖活性受到抑制（即IC50值）；saponin6在低浓度（<3.20μg/mL）剂量下，对HT-22细胞的细胞活性无明显影响；在药物浓度达到5.59μg/mL时，对HT-22细胞增殖活性的抑制率升至50%；
　　2.流式细胞周期检测显示：处理组（2.53μg/mL、5.06μg/mL）中处于S期的细胞比例分别为22.45±2.01%与16.50±1.22%，均较对照组S期（25.55±1.46%）减少，细胞增殖受到抑制；2.53μg/mL、5.06μg/mL saponin6作用U87细胞后G0/G1期细胞所占百分率由53.77±1.29%增加至63.98±2.83%与72.77±2.81%，说明细胞在G0/G1期受到阻滞。
　　【结论】：
　　1. Saponin6可抑制U87细胞的细胞活性，并呈时间、剂量依赖性；当saponin6在低浓度剂量下时，对小鼠HT-22细胞的细胞增殖活性无明显抑制作用；
　　2. Saponin6可影响U87细胞周期，并呈剂量相关性，通过影响G0/G1期细胞所占百分比，抑制细胞增殖。
　　第二部分：Saponin6诱导胶质瘤U87细胞凋亡
　　【目的】：研究saponin6对U87细胞凋亡作用影响。
　　【方法】：
　　处理组U87细胞培养基中加入saponin6共培养24 h，预设培养基saponin6终浓度分别为2.53、5.06μg/mL，采用 AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞术检测、TUNEL/Hoechst33342凋亡检测、透射电镜的方法探究不同浓度下药物对细胞凋亡的影响。
　　【结果】：
　　处理组TUNEL检测可见明显阳性信号点，2.53μg/mL组、5.06μg/mL组细胞的TUNEL阳性细胞百分率分别为24.44±1.58%、68.64±7.56%；AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术发现,与对照组相比，saponin6处理组细胞凋亡比例（包含早期、晚期凋亡）分别为44.33±3.21%、71.83±4.63%，且早期凋亡多于晚期凋亡；处理组Hoechst33342染色可见细胞核断裂及凋亡小体；与对照相比，透射电镜观察见典型凋亡细胞核形态学改变。
　　【结论】：
　　Saponin6可诱发U87细胞凋亡，并呈现出药物剂量相关性。
　　第三部分：Saponin6对胶质瘤U87细胞诱发凋亡的机制研究
　　【目的】：
　　研究saponin6诱发U87细胞凋亡的机制。
　　【方法】：
　　分别用2.53、5.06μg/mL saponin6处理胶质瘤U87细胞24 h后，通过蛋白印迹（Western blot）方法定量观察凋亡途径相关蛋白表达量变化。主要检测蛋白包括：外源途径（Fas/Fas-L/caspase8）、内源途径（Bax/Bcl2/caspase9）以及caspase3蛋白。所得实验结果均用所测蛋白标准化相对比表示（即：Pro目标/Pro内参灰度值之比）。
　　【结果】：
　　1.与正常条件培养组相比，加入saponin6后Western blot检测到cleaved-caspase3；随着药物浓度增加，cleaved-caspase3的相对表达量增加；
　　2.处理组中Fas、Fas-L、cleaved-caspase8/9蛋白水平的表达量增加，Bcl2蛋白表达量减少；与对照相比，未观测到(2.53、5.06μg/mL) saponin6组Bax蛋白表达量变化；
　　3. Saponin6处理组pro-caspase8/9/3蛋白表达量有增加的趋势，其中pro-caspase3/9在药物浓度为5.06μg/mL时相比对照组，蛋白表达量明显升高，且差异有统计学意义（P<0.05）。
　　【结论】：
　　saponin6可通过改变内、外源性信号途径相关蛋白表达量的变化，诱导胶质瘤U87发生凋亡。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、胶质瘤治疗的研究进展

二、中草药成分在胶质瘤治疗中的作用及其进展

第一部分 Saponin6对胶质瘤U87细胞增殖的影响

1实验材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 Saponin6诱导胶质瘤U87细胞凋亡

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三部分 Saponin6诱导胶质瘤U87细胞凋亡机制的研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢