靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147双模态SPECT/MRI探针的构建、表征及其应用研究

摘要

背景：
　　乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。尽管过去几十年，乳腺癌的诊断、治疗均取得巨大进展，但其死亡率紧随肺癌之后，位居第二。分子影像学的飞速发展，使人们对肿瘤的认识及研究进入了全新的分子时代，其突出特点是在细胞分子水平上实现对机体的实时、无创、动态、在体成像，对生物过程进行定性和定量研究，在疾病的早期诊断、肿瘤分期、疗效评价以及药物研发等方面有重要应用价值。尤其是多（双）模态分子影像学研究优势明显，是分子影像学发展的趋势，其核心内容是构建具有理想体内生物学特性的多（双）模态分子探针。以HAb18G/CD147为靶的肿瘤生物学特征多（双）模态分子影像学研究，可能有助于相关肿瘤的早发现、早诊断、转移预警、疗效评估以及预后评价等。
　　目的：
　　1.构建靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147双模态 SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2，对其理化性质及生物学特性进行表征研究。
　　2.培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468，探讨HAb18G/CD147在其中的表达及其意义，并进行双模态探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的体外细胞毒性研究。
　　3.初步探讨双模态探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2对人乳腺癌细胞的体外靶向性及特异性，并探讨其在正常小鼠体内的生物分布情况。
　　方法：
　　1.采用化学偶联法将超顺磁性氧化铁纳米颗粒SPIO与乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147的单克隆抗体片段 HAb18F(ab′)2共价结合，得到复合物SPIO-HAb18F(ab′)2；采用Iodogen法，对复合物SPIO-HAb18F(ab′)2进行125I标记，制备得到双模态靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2。本研究中采用SPIO及125I-HAb18F(ab′)2作为对照。应用透射电子显微镜、动态光散射仪等观察偶联前后SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的形态、大小及平均水合粒径，应用纸层析法计算125I-SPIO-HAb18F(ab′)2和125I-HAb18F(ab′)2的放射标记率，薄层层析法测定两者的放射化学纯度，并行体外稳定性实验及脂水分配系数（Octanol/water partition coefficient，log P）测定。采用1.5TMR磁共振仪对不同Fe2+浓度(3.0×10-2,2.0×10-2,1.5×10-2,7.5×10-3,3.75×10-3mmol/l)的SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2溶液行T2横向弛豫效率（r2）测定。
　　2.培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231（实验组）和MDA-MB-468（对照组），利用流式细胞术检测HAb18G/CD147在体外培养的乳腺癌细胞系中的表达情况。将靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2与非靶向探针SPIO分别与实验组MDA-MB-231细胞共孵育，行透射电子显微镜检测，观察靶向组探针在细胞内外的形态及分布，并与非靶向组比较。采用MTT法检测125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及SPIO溶液对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞存活率的影响。
　　3.（1）对与SPIO及125I-SPIO-HAb18F(ab′)2共同体外培养后的MDA-MB-231、MDA-MB-468及未作处理的MDA-MB-231细胞悬液（空白组）行MRI检测，对比其MRI信号强度的差异性，并计算MRI平均信号强度变化率；（2）体外细胞特异性结合实验：将与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及非靶向探针125I-HAb18F(ab′)2共同体外培养后的MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞悬液，在不同时间点（20min、40min、1h、2h、4h）经过离心、去上清及PBS重复冲洗后，用全自动γ放射免疫计数仪测每管放射性计数，分别计算其不同时间的细胞结合率并作统计学分析；（3）以125I-HAb18F(ab′)2为放射配基，进行体外细胞膜相关抗原竞争抑制实验，测定SPIO-HAb18F(ab′)2及HAb18F(ab′)2的半抑制率（IC50）；（4）正常昆明小鼠32只，随机分为2组，于尾静脉分别注射125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2，分别在15min、6h、24h、48h后解剖分离小鼠主要脏器及血液，测放射性生物（％ID/g）分布情况并进行血浆清除实验，计算125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2的血浆半衰期。
　　结果：
　　1.本研究成功构建靶向乳腺癌膜相关抗原 HAb18G/CD147的双模态 SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2，透射电子显微镜测得SPIO的核心粒径为（10.32±1.3）nm；动态光散射仪检测SPIO和125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的平均水合粒径分别为44.80nm和52.64nm；125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2的标记率分别为41.9%和85.8%，二者放射化学纯度均大于95%，在PBS及新鲜鼠血清中均具有较好的稳定性，脂水分配系数log P值分别为（-0.99±0.03）和（-1.49±0.08），表明二者均为水溶性物质；MR扫描结果显示：SPIO的横向弛豫效率为38.79mM-1·s-1，125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的横向弛豫效率为106.73mM-1·s-1。
　　2.人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468呈单层贴壁生长，流式细胞术检测结果证实 MDA-MB-231细胞高表达膜相关抗原 HAb18G/CD147，MDA-MB-468细胞呈低表达，其平均荧光强度分别为1353和162，前者约为后者的8.35倍。透射电子显微镜下显示125I-SPIO-HAb18F(ab′)2处理组：MDA-MB-231细胞靠近细胞膜及胞浆内见多个直径约20 nm的团块状致密电子密度颗粒集聚；SPIO组：纳米颗粒散在分布于MDA-MB-231细胞外周，无规律性，且距离细胞膜较远。MTT法测得125I-SPIO-HAb18F(ab′)2溶液在Fe2+浓度≤40μg/ml时对实验组及对照组细胞增殖均无明显抑制效应，差异无明显统计学意义（F值分别为0.78、0.66，P值分别为0.58、0.66）；SPIO溶液在Fe2+浓度≤40μg/ml时亦对两种细胞增殖无明显抑制效应，差异无明显统计学意义（F值分别为1.01、0.17，P值分别为0.45、0.24）。
　　3.（1）体外MR成像，MDA-MB-231细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2共孵育后呈明显短T2信号，余对照组及空白组呈明显高信号，测得MDA-MB-231细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2组、MDA-MB-231细胞与SPIO组、MDA-MB-468细胞与靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2组、MDA-MB-468细胞与SPIO组及空白组的信号强度平均值SI分别为（1670.5±4.55）、（1953.19±6.90）、（1932.31±7.89）、（2102.70±3.07）、（2348.63±13.50），差异有统计学意义（F=2859.60，P=0.000），与空白组相比，处理组信号强度改变率分别为28.87%、16.8%、17.72%、10.47%；（2）体外细胞特异性结合实验表明，实验组细胞可特异性摄取靶向探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2及125I-HAb18F(ab′)2，其在不同时间点的结合率均高于对照组细胞，二组间有明显统计学差异（F值分别为11.99、23.70，P值分别为0.009、0.001）；（3）体外细胞竞争抑制实验表明，SPIO-HAb18F(ab′)2对乳腺癌细胞膜相关抗原HAb18G/CD147保持了高亲和力，其IC50值为0.48nmol/L，HAb18F(ab′)2的IC50值为1.60nmol/L；（4）正常小鼠体内生物分布实验：125I-SPIO-HAb18F(ab′)2的血浆半衰期约为8.85h，主要浓聚于肝、脾并经肾脏排泄，10min时肝脏为（19.10±0.76）%ID/g、脾脏为（14.04±1.49）%ID/g、肾脏为（6.26±0.61）%ID/g，随时间延长，48h时肝脏为（2.70±0.43）%ID/g，脾脏为（1.96±0.65）%ID/g、肾脏为（0.45±0.02）%ID/g，分别降低了85.86%、86.04%、82.82%，肺、胃摄取相对较高，骨骼、肌肉分布较少；125I-HAb18F(ab′)2主要分布于血液中，其血浆半衰期约为10.38 h。
　　结论：
　　1.成功制备了靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147的特异性双模态SPECT/MRI探针125I-SPIO-HAb18F(ab′)2，该探针具有良好的理化性质和体外生物学特性，具有临床应用潜能。
　　2.双模态靶向探针125I-SPIO-HAb18(ab′)2可高效标记 HAb18G/CD147表达阳性的细胞，靶向性强，有望成为一种新型的HAb18G/CD147表达阳性的肿瘤的早期诊断手段。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、乳腺癌常规影像学检查研究进展

二、分子影像学研究进展

第一部分 靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147双模态SPECT/MRI探针的构建与表征

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

第二部分 乳腺癌细胞系培养、HAb18G/CD147表达及双模态SPECT/MRI探针的细胞毒性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 靶向乳腺癌膜相关抗原HAb18G/CD147双模态SPECT/MRI探针在体外细胞及正常小鼠体内的应用研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢