KLK4在子宫内膜腺癌中的表达和对RL95-2细胞侵袭的影响研究

摘要

背景：
　　子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势，由于症状出现较早，大多数患者能够早期诊断，经过手术治疗后整体预后较好，但仍有部分患者出现手术后肿瘤复发或早期转移，成为这部分患者预后较差的主要原因。目前已发现诸多和子宫内膜癌预后相关的分子标志物，如PTEN、P53、Ki67、K-ras等，但在临床上的应用仍有很多局限性。
　　人组织激肽释放酶（Kallikrein，KLK）属于丝氨酸蛋白酶家族，由KLK1-15构成，近年来发现KLK家族的成员涉及肿瘤的增殖、侵袭、耐药等多方面功能。KLK4是近些年KLK家族中研究较热的分子，其独特之处在于KLK4表达于细胞核，而其他的KLK家族成员表达于细胞质。已发现KLK4在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌中呈高表达，且能促进前列腺癌细胞的增殖和卵巢癌细胞的侵袭转移，机制研究表明KLK4能调节细胞周期蛋白的表达，促进肿瘤细胞上皮间质转化，且KLK4的表达受性激素的调节。目前已有报道KLK4在子宫内膜癌中高表达，但具体的作用和机制未知。
　　子宫内膜癌是典型的激素依赖性肿瘤，基于KLK4在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌中的作用，我们考虑KLK4在子宫内膜癌中也可能存在一定作用。在本实验中，我们分别从KLK4在子宫内膜癌中的表达和临床病理参数及预后之间的关系，对子宫内膜癌细胞功能的影响及可能的机制等几个层面做了探讨。
　　第一部分、KLK4在子宫内膜癌中的表达及临床意义
　　目的：探讨KLK4在子宫内膜癌中的表达及临床意义，为改善子宫内膜癌的预后提供新的思路。
　　方法：免疫组化法检测81例子宫内膜癌、30例不典型增生的子宫内膜和30例正常子宫内膜中KLK4的表达情况，收集患者临床病理资料，结合随访资料做生存分析，得出KLK4的表达和子宫内膜癌预后的关系。
　　结果：KLK4主要定位在细胞核，在正常内膜、不典型增生内膜和子宫内膜癌中的高表达率分别为30％、53%、67%，差异有统计学意义（P=0.002）；KLK4的高表达和子宫内膜癌的分化程度及深肌层浸润相关（P=0.021，P=0.031），与年龄、临床分期、淋巴结转移无关；KLK4高表达组的5年无进展生存率较低表达组更低，差异有统计学意义（P=0.032）。
　　结论：KLK4的高表达可能与子宫内膜癌细胞的分化程度和局部侵袭有关，高表达提示早期复发，有可能作为预测子宫内膜癌早期复发的标志物。
　　第二部分、KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达和雌激素对KLK4的调节作用
　　目的：探讨KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达情况及雌激素对KLK4表达的影响
　　方法：Real-time PCR及Western blot检测KLK4mRNA及蛋白在Ishikawa、HEC-1B及RL95-2细胞中的表达。用不含雌激素的培养基培养Ishkawa细胞，分别加入10-10mol/L、10-8mol/L及10-6mol/L的17-β雌二醇培养，分别在24h、48h、72h检测KLK4mRNA及蛋白的表达量。再以最佳作用浓度的雌激素联合10-9mol/L、10-7mol/L及10-5mol/L的雌激素受体拮抗剂ICI182,780作用于Ishkawa细胞，观察雌激素受体拮抗剂对KLK4表达的影响。
　　结果：KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达强度由高到低依次为HEC-1B、Ishikawa、RL95-2。雌激素能促进Ishkawa细胞中KLK4的表达，以10-8mol/L作用48h最明显。ICI182,780能阻断雌激素对KLK4表达的上调作用，当浓度为10-7mol/L时阻断效果最明显。
　　结论：雌激素能够上调子宫内膜癌细胞中KLK4的表达，雌激素受体拮抗剂能阻断雌激素对KLK4表达的上调作用。推测雌激素能够通过雌激素受体促进子宫内膜癌细胞中KLK4的表达。
　　第三部分、过表达KLK4对子宫内膜癌细胞功能的影响
　　目的：探讨KLK4在子宫内膜癌细胞中可能存在的作用。
　　方法：以pcDNA3.1(+)为载体构建KLK4过表达质粒，转染至KLK4低表达的RL95-2细胞，通过G418连续筛选获得稳定过表达KLK4的RL95-2细胞。MTT法检测过表达KLK4对RL95-2细胞增殖的影响，划痕实验及transwell侵袭实验检测过表达KLK4对RL95-2细胞体外迁移及侵袭能力的影响。
　　结果：成功构建KLK4的过表达质粒并建立稳定过表达KLK4的细胞系。MTT实验显示过表达KLK4不能促进RL95-2细胞的增殖，但划痕实验及transwell侵袭实验显示其体外迁移和侵袭能力较对照组明显增加。
　　结论：KLK4过表达能促进RL95-2细胞的体外迁移及侵袭能力，但不能促进其增殖。
　　第四部分、过表达KLK4促进RL95-2细胞侵袭机制的初步研究
　　目的：初步探讨过表达KLK4促进RL95-2细胞体外侵袭的可能机制。
　　方法：Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测过表达KLK4后e-cadherin mRNA及蛋白的表达变化。构建e-cadherin的过表达质粒，瞬时转染入稳定过表达KLK4的RL95-2细胞，观察e-cadherin表达及细胞体外侵袭能力的变化。
　　结果：过表达KLK4的RL95-2细胞中e-cadherin表达水平较空白组和对照组明显下降，过表达e-cadherin可使KLK4过表达介导的侵袭作用下降。
　　结论：KLK4可能是e-cadherin的抑制因子，通过抑制e-cadherin表达促进RL95-2细胞侵袭转移。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 宫内膜癌简介

2.KLK4

3.e-cadherin

第一部分 KLK4在子宫内膜癌中的表达及临床意义

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第二部分 KLK4在子宫内膜癌细胞中的表达及雌激素对KLK4表达的调节作用

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

第三部分 过表达KLK4对RL95-2细胞功能的影响

1.材料

2 方法

3.结果

4 讨论

第四部分 过表达KLK4促进RL95-2侵袭的机制初步研究

1 材料

2.方法

3.结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢