5-HT及其受体在异氟烷麻醉—觉醒调节中的作用及机制

摘要

自1846年乙醚被成功应用于手术麻醉起，才真正诞生了现代意义上的手术外科学。在其后的100多年间，多种新型麻醉药物相继问世。时至今日,全球每年有近2亿人接受不同类型的手术治疗，其中的绝大多数都需要接受麻醉，麻醉的使用范围越来越广。然而，全麻药物是如何发挥麻醉效应，实现可逆性意识消失(Loss of Consciousness，LOC)的，却一直未得到合理解释。这一问题已成为外科麻醉界和神经科学界一个倍受关注的研究课题。2005年Science杂志更是将“How do general anesthetics work?”列入了当今人类亟待解决的125个重要科学问题之一。
　　已有研究证实，在中枢神经系统尤其是大脑中，存在多个与全麻机制相关的神经递质系统，包括被广泛认为促麻醉和睡眠的GABA能系统和促麻醉觉醒的orexin能系统，然而这两个系统是如何相互作用的至今仍不清楚。5-羟色胺（5-HT）是一种单胺类神经递质，存在于胃肠道嗜铬细胞、血小板和中枢神经系统中，在中枢由5-HT能神经元合成。以往实验已证明5-HT在生理睡眠与觉醒中发挥重要作用，但是对5-HT究竟是促睡眠还是促觉醒，目前还没有一致结论，我们分析可能和5-HT不同亚型的受体作用有关，但是目前这方面还没有系统的研究。另外，5-HT在麻醉-觉醒机制中的作用尚未被研究，本实验试图通过对5-HT及其受体的研究，观察其在全身麻醉特别是苏醒过程中的作用，并初步探索其作用机制。
　　实验1
　　目的：通过侧脑室注射的方法观察5-HT及其受体在异氟烷麻醉-觉醒调控中的作用。
　　方法：雄性SD大鼠（体重250-280g），按随机分组法分为14组（I-XIV，n=6）。在2％戊巴比妥40-60mg/kg腹腔麻醉下，将微注射套管埋置于侧脑室，并在颅骨表面固定。大鼠在术后休息5天后隔天进行一次异氟烷麻醉-觉醒实验。将大鼠置入翻转麻醉箱并给予1.5%的异氟烷麻醉,记录麻醉诱导时间（翻正反射消失时间）。麻醉诱导成功后第15min，同一组大鼠前后三次实验分别随机给予5μL saline或两种不同剂量的同一种5-HT/受体激动剂或拮抗剂（具体给药试剂及剂量见表2），泵注时间5min。麻醉30min后（即给药结束10 min后）停止异氟烷吸入，观察大鼠翻正反射恢复时间，即异氟烷的麻醉觉醒时间。
　　结果: I组动物侧脑室注射0.5umol5-HT后异氟烷麻醉的觉醒时间缩短（P<0.05），II组动物侧脑室注射20μg5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT后异氟烷麻醉觉醒时间显著缩短（P<0.01），III组动物侧脑室注射50μg5-HT1A受体拮抗剂WAY100635后，异氟烷麻醉觉醒时间延长（P<0.001）。VI组动物侧脑室注射5μg5-HT2A/C受体激动剂DOI后麻醉觉醒时间也缩短（P<0.05），VIII组动物侧脑室注射25μg5-HT2C受体拮抗剂RS102221后麻醉觉醒延迟（P<0.05），其余组动物侧脑室给予5-HT1B、2A、3A、6、7型受体激动剂和拮抗剂后对异氟烷麻醉觉醒无明显影响（P>0.05）。
　　实验2
　　目的：通过Pef区微注射5-HT1A受体激动剂和拮抗剂研究其在异氟烷麻醉-觉醒调控中的作用和机制。
　　方法：
　　2.1观察Pef区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠诱导和觉醒时间的影响：SD大鼠（250-280g）随机分为I、II两组（n=6），先在Pef区放置微注射套管。5天后每组各进行三次异氟烷麻醉觉醒实验，异氟烷吸入开始后先观察诱导时间，大鼠翻正反射消失时间为诱导时间。而后，在麻醉15 min后I组动物侧脑室随机注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT，II组动物侧脑室随机注射0.3ul saline、1.5或3.0μg5-HT1A受体拮抗剂WAY10635，观察觉醒时间，翻正反射恢复时间为觉醒时间。
　　2.2Pef区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠脑电的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为 I-III三组（n=6），先进行脑电监测电极及 Pef核团微注射套管埋置术，5天后进行脑电观察实验。将电极接入脑电检测仪，记录10min清醒状态脑电波后，将大鼠放入0.75MAC异氟烷的翻转箱40min后，I组Pef注射5μL saline，II组注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT1.2μg，III组注射5-HT1A受体拮抗剂WAY1006353.0μg，继续记录脑电波30min，比较给药前后10min期间脑电图的变化。2.3Pef区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠神经元Fos表达的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为I-IV四组（n=6），实验前在Pef核团行微注射套管埋置术，5天后I组大鼠心腔注射10%KCL处死后多聚甲醛灌注取脑。II、III、IV接受1.5%异氟烷麻醉第15min后Pef分别注射0.3ul saline、1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受体拮抗剂WAY100635，麻醉第30min甲醛灌注取脑。所有脑块切片后进行 orexin和c-Fos免疫荧光双标染色，以观察 Pef区域Orexin神经元的活化状态。
　　2.4Pef区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠血中orexin水平的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为I-III三组（n=6）,先行Pef核团微注射套管埋置术，5天后进行放射免疫实验。大鼠用1.5%异氟烷进行麻醉，仰卧固定于动物手术台，将微注射管置入套管中。麻醉第15min三组分别泵入0.3μL saline、1.2μg8-OH-DPAT和3.0μgWAY100635。于翻正反射消失时、麻醉第30min各从股静脉抽取2ml静脉血。提取血清后进行放射免疫实验，测血清中orexin含量。
　　结果:Pef给予1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT使异氟烷麻醉觉醒时间明显延长（P<0.001）,而给予1.5μg和3.0μg5-HT1A受体拮抗剂WAY100635均使麻醉觉醒时间缩短（P<0.05，P<0.001）。1.2μg8-OH-DPAT可使脑电波的δ波明显减少，出现暴发性抑制，并使 Pef区域 c-FOS阳性 orexin神经元数目比盐水组明显减少（P<0.05），外周静脉血中Orexin含量降低（P<0.05），3.0μg WAY100635对0.75MAC异氟烷麻醉状态下的大鼠的脑电波没有明显影响，但是可以使 c-Fos阳性的 Orexin神经元数目增多（P<0.05）、外周血Orexin含量升高（P<0.05），产生与8-OH-DPAT相反的作用。
　　实验3
　　目的：探索VLPO区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉觉醒时间的影响及其机制。
　　方法：
　　3.1VLPO区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠觉醒时间的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为I、II两组（n=6），实验前先在VLPO区埋置微注射套管。5天后每组各进行三次异氟烷麻醉觉醒实验。从异氟烷吸入开始，观察动物的麻醉诱导时间。大鼠翻正反射消失时间为诱导时间。麻醉后15 min后I组动物VLPO区注射0.3μLsaline、0.6或1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT，II组动物VLPO区注射0.3μLsaline、1.5或3.0μg5-HT1A受体拮抗剂WAY10635，观察大鼠的觉醒时间。翻正反射恢复时间为觉醒时间。
　　3.2VLPO区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠脑电的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为I、II、III三组（n=6），脑电监测电极及VLPO核团微注射套管埋置术，5天后进行脑电观察实验。将电极接入脑电检测仪，记录10min清醒状态脑电波，将大鼠放入0.75MAC异氟烷的翻转箱40min。随后5min内，I组Pef注射5μLsaline，II组注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT1.2μg，III组注射5-HT1A受体拮抗剂WAY1006353.0μg，继续记录脑电波30min，比较给药前后10min脑电波变化记录给药前后脑电图变化。
　　3.3VLPO区注射5-HT1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉大鼠GABA神经元Fos表达的影响：SD大鼠（250-280g）被随机分为I-IV四组（n=6），实验前在VLPO核团行微注射套管埋置术，5天后I组大鼠心腔注射10%KCL处死后多聚甲醛灌注取脑。II、III、IV接受1.5%异氟烷麻醉第15 min后VLPO分别注射0.3μL saline、1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OHDPAT和3.0μg5-HT1A受体拮抗剂WAY100635,麻醉第30min甲醛灌注取脑。所有脑块切片后进行GABA和c-Fos免疫荧光双标染色，以观察VLPO区域GABA神经元的活化状态。
　　结果：VLPO区注射1.2μg5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT后，异氟烷麻醉觉醒时间明显缩短（P<0.05），而注射3.0μg其拮抗剂WAY100635使麻醉觉醒时间延长（P<0.05）。另外，8-OH-DPAT可以使0.75MAC异氟烷麻醉下的大鼠脑电波的δ波明显减少，出现类觉醒波，甚至发生觉醒的行为学表现。3.0μg WAY100635对大鼠脑电波形没有明显影响。免疫荧光试验结果尚未完成。
　　小结：本研究中我们通过三个步骤的实验，首先证明了侧脑室注射5-HT的总体效应是促进异氟烷麻醉大鼠的觉醒，并证明其作用可能是通过其1A和2C受体产生的；其次，和我们预想的结果相反，我们发现Pef区orexin神经元的5-HT1A受体兴奋，反而抑制了麻醉觉醒；最后，我们证明5-HT可以通过5-HT1A受体，抑制VLPO区GABA能神经元的活动，而促进麻醉觉醒。以上结果反映了5-HT在脑内不同核团作用的复杂性，为全麻机制的网络学说提供了新的资料。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

（一）全身麻醉的作用机制

（二）睡眠-觉醒神经通路

（三）5-HT在全麻机制及睡眠中的作用

实验一 侧脑室微注射 5-HT 及其受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉觉醒的影响

1 材料

2 方法

3 结果

实验二Pef微注射5-HT 1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉觉醒的影响

1 材料

2 方法

3 结果

实验三VLPO微注射5-HT 1A受体激动剂/拮抗剂对异氟烷麻醉觉醒的影响

1 材料

2. 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢