过表达CREG的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的作用及机制研究

摘要

实验背景：
　　心肌梗死(myocardial infarction，MI)是常见的致死性疾病之一，即使患者度过急性期，也可能会由于成体心肌细胞的再生能力不足，使心肌细胞发生不可逆的丢失，进一步坏死心肌组织会被纤维瘢痕组织替代，最终导致心力衰竭的发生。研究发现，应用骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)移植技术治疗MI能够有效防止病理性心室重构，增强心脏收缩功能，促进心功能恢复。BMSCs移植到梗死心肌边缘区后，可通过旁分泌多种生长因子诱导血管新生，从而改善梗死区微环境进而发挥功效。因此，通过人工干预手段提高BMSCs移植后的促血管新生因子旁分泌的作用，始终是心血管病学、组织工程学和再生医学领域的研究热点。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)在成体组织细胞中广泛表达，但是在原始干细胞中几乎不表达。研究发现，在血管内皮细胞中，CREG可促进其分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)；而在胚胎干细胞中，过表达CREG可促进其向内皮细胞定向分化并形成新生血管。我们的前期体外研究也发现，BMSCs过表达CREG后，能够在体外对抗病理条件导致的细胞凋亡。但是，在体情况下，CREG基因修饰的BMSCs对急性MI的治疗作用及机制均不清楚。因此，本研究拟通过动物体内实验阐明过表达CREG后BMSCs治疗MI的效果并探讨其机制，为防治心肌梗死提供新的治疗手段和理论依据。
　　实验目的：
　　1.明确过表达CREG的BMSCs移植对大鼠心肌梗死的治疗作用；
　　2.明确过表达CREG的BMSCs移植是否通过促进旁分泌及血管新生发挥减轻MI损伤的作用；
　　3.明确CREG是否通过上调HIF-1α促进BMSCs的旁分泌作用。
　　实验方法：
　　1.过表达CREG的BMSCs建立：利用表达CREG-GFP和GFP的腺病毒分别感染BMSCs，建立CREG过表达的BMSCs(CREGBMSCs)和感染对照组BMSCs(GFPBMSCs)。通过荧光显微镜观察转染效果，当转染效率达95％以上后，可用于进行干细胞移植。2.大鼠MI模型的制备：利用2%异氟烷挥发性麻药麻醉大鼠并固定于操作台上，经其左侧胸骨的第4、5肋间将心脏暴露，通过结扎大鼠的心脏冠脉左前降支(left anterior desending coronary artery，LAD)建立MI模型；然后在梗死心脏边缘区域进行5个点注射治疗。根据注射成分的不同将大鼠分为4组，分别是注射对照组(PBS组)，普通BMSCs(NormBMSCs)治疗组，GFPBMSCs治疗组和CREGBMSCs治疗组。
　　3.干细胞移植治疗MI后的第3天与14天，
　　(1)利用小动物超声测定大鼠心功能；
　　(2)采用Masson染色检测小鼠心肌纤维化程度；
　　(3)利用Western blots方法检测心肌组织中凋亡指标cleaved Caspase-3表达水平；
　　(4)利用ELISA方法检测心肌组织中VEGF的表达水平；
　　(5)通过共聚焦显微镜观察心肌组织中CD31的表达水平；
　　4.体外模拟缺氧环境，通过ELISA方法检测过表达CREG对BMSCs的旁分泌生长因子影响，同时采用Matrigel方法观察其对血管新生的影响。
　　5.通过Western blot方法以及Real-time PCR方法来，探讨体外缺氧条件下CREG调控BMSCs旁分泌的分子机制。
　　实验结果：
　　1.体内部分
　　(1)过表达CREG的BMSCs治疗组(CREGBMSCs)的大鼠第3天与第14天的射血分数(ejection fraction，EF)和短轴缩短率(fractional shortening，FS)比PBS组、NormBMSCs治疗组以及 GFPBMSCs治疗组均有明显的改善。这一结果表明，CREG过表达可提高BMSCs移植治疗MI的效果，使心功能得到进一步的改善。
　　(2) CREGBMSCs治疗组的大鼠心脏纤维化面积明显少于PBS组、NormBMSCs治疗组和GFPBMSCs治疗组。这一结果表明，CREG过表达的BMSCs移植治疗可进一步减少心肌纤维化的发生，从而延缓心室重构。
　　(3)无论在3天还是14天时间点，CREGBMSCs治疗组的大鼠心肌凋亡指标cleaved Caspase-3表达水平明显低于其他3组。这一结果表明，CREG过表达BMSCs移植治疗可以进一步减少心肌细胞凋亡的发生。
　　(4)无论在3天还是14天时间点，CREGBMSCs治疗组的大鼠心脏的血管新生都明显多于其他3组。这一结果表明，CREG过表达BMSCs移植治疗可进一步促进血管新生，从而改善梗死区微环境。
　　(5)过表达CREG能够延缓移植后BMSCs的凋亡，同时延长VEGF的旁分泌作用。2.体外部分
　　(1)体外缺氧条件下，CREG过表达可以促进BMSCs分泌VEGF；培养 CREGBMSCs的上清液可以促进体外内皮细胞血管网的形成。
　　(2) CREG促进HIF-1α的表达以及核转位。
　　(3)通过HIF-1α的siRNA抑制实验证实，CREG通过调控HIF-1α促进VEGF分泌，进而促进血管新生。
　　(4)过表达CREG降低VHL（降解HIF-1α的主要分子）mRNA合成，继而上调HIF-1α。
　　实验结论：
　　1.过表达CREG的 BMSCs移植治疗能够进一步提高BMSCs改善MI心功能，同时减少纤维化和心肌凋亡发生的作用；
　　2.过表达CREG的BMSCs其旁分泌VEGF及促血管新生的作用进一步增强；
　　3. CREG通过减少调控HIF-1α降解的VHL的mRNA合成使HIF-1α表达增加，进而上调VEGF分泌，促进血管新生。

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前言

文献回顾

1 心肌梗死

2缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors, HIFs）

3 E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)

第一部分 过表达CREG的BMSCs具有减轻MI损伤的作用

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分 CREG通过抑制BMSCs凋亡促进旁分泌与血管新生减轻MI损伤

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 CREG通过HIF-1α/VHL途径促进缺氧条件下BMSCs的VEGF旁分泌

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢