GEBP11多功能磁性纳米探针对动脉斑块及肿瘤血管新生的多模态分子影像研究

摘要

背景：
　　恶性肿瘤和动脉粥样硬化是世界范围内危害人类健康的主要疾病，发病率均逐年上升，对其发病机制和疾病特征的研究有助于改进诊断方法和提高疗效。近年来，大量研究证实：血管新生广泛参与肿瘤和动脉粥样硬化的发生发展，且可能作为核心事件发挥关键作用。肿瘤生长和转移依赖性的需要血管生成，抗血管治疗可使肿瘤体积显著缩小，延长患者生存时间。发生于动脉粥样硬化斑块内的血管新生可显著增加斑块的易损性，而抗血管治疗能缩小斑块面积，增加其稳定性。常规影像学技术不能满足检测肿瘤和动脉斑块中血管新生的临床需求，尝试新的成像靶点，改进成像方法具有重要的现实意义。分子影像学是一门新兴的具有广阔临床应用前景的学科，它可以结合多种成像模式在活体状态对疾病进程中的病理性分子进行定性和定量研究。选择特异的分子探针进行各种模态的分子成像，有助于对疾病做出早期诊断。
　　GEBP11是本课题组利用噬菌体随机肽库技术，基于人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）与肿瘤细胞共培养模型，经多轮筛选获得的环状九肽。我们前期研究证实，GEBP11与正常HUVEC亲合力不高，对经过肿瘤细胞刺激，处于活化状态的共培养人脐静脉内皮细胞（Co-cultured human umbilical vein endothelial cell,Co-HUVEC）表现出很强的亲和力，具有特异性靶向新生血管的能力。进一步研究发现，GEBP11在放射性核素131I标记后，既可作为影像学探针对活体胃癌血管进行切伦科夫和单光子发射计算机断层扫描(single photon emission computed tomography,SPECT)双模态分子成像，又可作为放射性药物发挥治疗效用。尽管GEBP11具有易于合成修饰、组织穿透力强、免疫原性低、造价低廉等优点，但与抗体等大分子蛋白相比，其在体内血浆清除率高、半衰期短，需通过化学方法改善其药代动力学表现以提升应用价值。
　　磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)以其独特的物理化学性质，可作为优良的诊断治疗工具应用于生命医学领域。经二巯基丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)等生物相容性材料表面修饰后，将粒径大小适宜的MNPs与肽、抗体等生物活性分子连接，可显著延长后者在血液循环中的停留时间，改善其生物学分布。与此同时，MNPs自身就是磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)的对比剂，又可作为载体连接荧光染料或放射性核素，将多种成像模态融合。此外，MNPs还可用于携带化疗药物、放射性核素、微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)等发挥治疗作用。
　　因此，我们设想构建一种由GEBP11来特异性靶向新生血管，MNPs作为多功能载体，适用于MRI、荧光成像（fluorescence imaging,FI）和正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography,PET)等多种影像学平台的智能磁性纳米探针成像系统，并评估将其用于肿瘤和动脉粥样硬化斑块多模态分子成像的可行性。
　　研究目的：
　　1.构建具有新生血管靶向能力，可用于荧光和MR双模态分子成像的磁性纳米颗粒Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，对其进行表征，体外研究其对Co-HUVEC的靶向能力和细胞毒性。
　　2.建立荷瘤裸鼠模型，通过荧光及磁共振成像技术在体评估Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs对肿瘤新生血管的fluorescence/MR双模态分子成像的应用价值。
　　3.构建具有新生血管靶向并具备PET或MR分子成像能力的磁性纳米颗粒NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs，进行探针的物理化学表征，体外研究确定其对Co-HUVEC的靶向能力和分析细胞毒性。创建68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs和GEBP11-DMSA-MNPs对兔动脉粥样硬化斑块中新生血管的PET或MR分子成像方法，为易损斑块的识别提供无创影像手段。
　　研究方法：
　　1.在含有油酸的有机溶剂中热分解乙酰丙酮铁，获得油性包覆的疏水MNPs，将其与DMSA进行表面配体交换反应，获得水溶性单分散DMSA-MNPs。使用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)、动态光散射(dynamic light scattering,DLS)、振动样品磁强计(vibrating sample magnetometer,VSM)对其进行表征。
　　2.在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)和氮-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide,NHS)催化下，通过缩合反应将GEBP11和Cy5.5连接到DMSA-MNPs上，并使用TEM、DLS、VSM对Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs进行表征。
　　3.在EDC和NHS催化下，通过缩合反应将GEBP11和螯合剂NOTA连接到DMSA-MNPs上，使用TEM和DLS对NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs进行表征。
　　4.在体外对浓度梯度的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs分别进行fluorescence/MR成像，鉴定其光学和磁学特征。
　　5.将Co-HUVEC与Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs共孵育12小时，使用普鲁士蓝染色、激光扫描共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope，CLSM)检测Co-HUVEC对MNPs的摄取。
　　6.将NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs与Co-HUVEC共培养24h，普鲁士蓝检测细胞对其摄取，流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测其凋亡和细胞周期。
　　7.制备裸鼠皮下胃腺癌荷瘤模型，尾静脉注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs探针，在不同时间点进行荧光和 MR成像，分析其在体靶向肿瘤血管的能力，观察其组织器官分布情况。对肿瘤切片行普鲁士蓝和CD31免疫组化染色，以明确纳米颗粒在肿瘤组织中的定位。
　　8.制作球囊损伤腹主动脉合并高脂饮食喂养诱发新西兰兔动脉粥样硬化模型，通过超声和血管内超声（intravenous ultrasound，IVUS）观察斑块形成，组织学染色鉴定斑块成分。
　　9.将放射性核素68Ga螯合到NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs上，耳缘静脉注射68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs后PET成像。注射GEBP11-DMSA-MNPs并于注射前后4小时行MR成像。取标本行普鲁士蓝染色，检测斑块组织中的纳米颗粒。
　　结果：
　　1.成功合成了平均粒径10nm左右，大小均一，平均水合粒径63.2±4.1nm的DMSA-MNPs。其饱和磁化强度为62.7emu/g，可在水溶液中长期保存，无聚集和沉淀。
　　2.连接GEBP11和Cy5.5后，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs的平均水合尺寸增加到82.8±6.5nm，饱和磁化强度减少为50.3emu/g，在水溶液中颗粒分散性稳定。
　　3.TEM显示，NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs的铁核心平均粒径大约12nm，粒径分布较为均一，水合尺寸大约143nm，饱和磁化强度49.7emu/g，可在溶液中保持稳定。
　　4.随着Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs浓度增加，磁共振T2弛豫时间缩短，荧光信号增强，表现为磁共振T2加权图像逐渐变暗，而荧光图像逐渐变亮，信号变化与探针浓度线性相关。激光共聚焦显微镜发现被细胞内化的Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs主要位于胞浆。
　　5.将Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs与内皮细胞共孵育12小时后，内皮细胞的磁共振T2弛豫时间缩短，荧光信号增强普鲁士蓝染色显示。与非GEBP11靶向组相比，Co-HUVECs对Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs摄取显著增多。
　　6.与无关对照肽组相比，Co-HUVEC对NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs摄取显著增加。流式细胞检测结果证实，与正常细胞相比，摄取NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs后Co-HUVEC的凋亡和细胞周期无明显变化。
　　7.活体荧光成像显示，荷瘤裸鼠尾静脉注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs，肿瘤组织在注射后24小时明显显像，其荧光信号在注射后36小时显著强于其它器官，且洗脱相对缓慢。磁共振T2加权像成像结果显示，与注射Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs前相比，肿瘤部位信噪比在注射后24小时和36小时分别平均降低约18.3％和23.7%。普鲁士蓝和CD31免疫组化染色证实，Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs特异性蓄积于肿瘤新生血管。
　　8.球囊损伤合并高脂饮食喂养12周成功诱导新西兰兔腹主动脉斑块形成。
　　9.PET/CT成像结果显示，68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs可被腹主动脉斑块摄取。磁共振成像显示，GEBP11-DMSA-MNPs注射后4小时斑块组织T2加权像信噪比降低约19.3%。普鲁士蓝和CD31染色证实GEBP11-DMSA-MNPs特异性蓄积于斑块新生血管。
　　结论：
　　通过本课题的研究，我们成功制备了具有新生血管靶向性的多功能磁性纳米颗粒，在体内和体外证实GEBP11靶向的DMSA-MNPs可特异性的对共培养血管内皮细胞有高亲和力。Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs可用于Fluorescence/MR双模态成像诊断肿瘤的血管新生。68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs和GEBP11-DMSA-MNPs分别用于PET或MR成像发现动脉粥样硬化斑块新生血管。此外，考虑上述磁性纳米颗粒具有良好的组织相容性和药代动力学特征，除作为成像探针外，还有望成为载药工具应用于靶向性抗血管新生治疗。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 血管新生

2 血管新生与恶性肿瘤

3 血管新生与动脉粥样硬化

4 GEBP11用于血管新生分子影像的研究

5 磁性纳米颗粒在疾病诊断和治疗中的应用

第一部分GEBP11多功能磁性纳米探针的制备和表征

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

第二部分Cy5.5-GEBP11-DMSA-MNPs探针对胃癌荷瘤裸鼠肿瘤血管新生的多模态成像

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分68Ga-NOTA-GEBP11-DMSA-MNPs探针对动脉斑块血管新生的多模态成像

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢