人参皂甙Rd对成年大鼠缺血性脑卒中后血管发生的机制研究

摘要

缺血性脑卒中以其高发病率、高死亡率和高致残率成为影响全球健康的首要杀手。脑血流一旦被阻塞超过数分钟，神经细胞便发生不可逆的损伤和死亡。人参皂甙（Ginsenoside Rd，GSRd）是从三七、人参中提取的有效单体成分，本课题组前期的实验显示GSRd除了可以促进大鼠MCAO后梗死灶周围的微血管发生，还可以促进体外培养人脐静脉微血管内皮细胞（human umbilical vein microvascular endothelial cells，HUVECs）的管腔形成，并初步发现GSRd的作用与Hif-1α的激活相关。本课题拟应用免疫组化、Western blot、人脐静脉微血管内皮细胞培养等技术，分别在体内和体外，进一步探讨GSRd的促血管发生作用机制是否与信号通路AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF的序列性激活相关。
　　实验一人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的影响
　　目的：进一步验证GSRd对成年大鼠脑梗死后血管发生的影响。
　　方法：160只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重280~300g，采用MCAO模型，随机分为4组：Sham+SA组，Sham+GSRd组，MCAO+SA组，MCAO+GSRd组。造模成功6 h后开始腹腔注射GSRd10 mg/kg/d，连续7 d，MCAO对照组给予同体积生理盐水，并分别在PSD1、PSD3、PSD7、PSD14和PSD21留取大鼠脑标本行冰冻切片，用 RECA-1单克隆抗体分别标记不同时间点大鼠的微血管，观察缺血半暗带区微血管的密度和分支点的变化。
　　结果：各Sham组之间微血管密度和分支点无变化（P>0.05，Sham+SA组 vs. Sham+GSRd组）；MCAO+SA组微血管的密度和分支点在PSD1明显减少（P<0.05），在PSD3、PSD7和PSD14时微血管的密度和分支点呈逐渐上升的趋势，并且在PSD14达到峰值，PSD21有所下降（MCAO+SA组 vs. Sham组）；MCAO+GSRd组微血管密度和分支点在各时间点的变化趋势和MCAO+SA组基本一致，但其微血管密度和分支点在每个时间点均高于MCAO+ SA组（P<0.05，MCAO+ GSRd组 vs. MCAO+SA组）。
　　结论：GSRd可明显促进大鼠脑梗死后微血管的发生。
　　实验二人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的机制研究
　　目的：探索GSRd促进血管生长因子靶点是否包括Hif-1α的上游因子AKT和mTOR，进而探讨GSRd是否通过激活信号通路AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF而发挥促血管发生的作用。
　　方法：（1）成年雄性SD大鼠随机分为4组：Sham+SA组，Sham+GSRd组，MCAO+SA组，MCAO+GSRd组。MCAO模型成功后6 h开始腹腔注射给药GSRd10 mg/kg，连续给药3 d。在PSD3，应用Western blot检测半暗带区脑组织中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达水平。（2）成年雄性SD大鼠随机分为3组：MCAO+SA，MCAO+GSRd，MCAO+GSRd+雷帕霉素。造模30 min前腹腔注射雷帕霉素250 ug/kg，后再连续给药2 d，MCAO模型成功后6 h腹腔注射GSRd10 mg/kg，连续3 d后，用Western blot检测半暗带区脑组织中的VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达变化，观察雷帕霉素抑制mTOR的激活后，其下游因子表达的情况。（3）成年SD大鼠随机分为3组：MCAO+SA组，MCAO+GSRd组，MCAO+GSRd+ LY294002组。侧脑室立体定位埋入脑室套管，待大鼠恢复5 d后行MCAO模型，每天经脑室套管注射AKT抑制剂LY294002（10 mM，5 ul），腹腔注射GSRd10 mg/kg/d，两者均连续3 d，用Western blot检测半暗带区脑组织中VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的蛋白表达变化。（4）分组同（3），大鼠连续用LY294002和GSRd，方法同（3），连续给药7 d脑组织冰冻切片后，用RECA-1单克隆抗体免疫组化染色，观察LY294002对大鼠微血管的影响。
　　结果：（1）在PSD3，Sham组之间VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达无差别（P>0.05，Sham+SA组 vs. Sham+GSRd组）；MCAO后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达均下降（P<0.05，MCAO+SA组 vs. Sham组）；GSRd可明显促进VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达（P<0.05，MCAO+GSRd组 vs. MCAO+SA组）。（2）在加入mTOR特异性阻断剂雷帕霉素后，mTOR的活化形式p-mTOR以及其下游Hif-1α和VEGF的表达均明显降低（P<0.05），而其上游p-AKT的表达不受影响（P>0.05，MCAO+GSRd+雷帕霉素组 vs. MCAO+GSRd组）。（3）在加入AKT抑制剂LY294002后，p-AKT、p-mTOR、Hif-1α和VEGF的表达均明显降低（P<0.05，MCAO+GSRd+LY294002组 vs. MCAO+GSRd组）；（4）LY294002可明显减少半暗带区微血管密度（P<0.01，MCAO+GSRd+LY294002组 vs. MCAO+GSRd组=426.56±48.38 vs.532.03±16.17），同时减少分支点（P<0.01，MCAO+GSRd+LY294002组 vs. MCAO+GSRd组=212.50±24.32 vs.330.47±20.44）。
　　结论：在体内，GSRd促进血管发生的作用可能与AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF信号通路激活相关。
　　实验三人参皂甙Rd对体外培养人脐静脉微血管内皮细胞（HUVECs）的作用
　　目的：在体外培养的HUVECs中探讨GSRd是否通过AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF的激活而发挥促血管发生的作用。
　　方法：（1）模型的建立。采用氧糖剥夺/再灌注损伤模型（oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD）。体外培养HUVECs，实验分为5组：正常培养组、OGD组、OGD+GSRd1 uM组、5 uM组、10 uM组。正常培养的HUVECs氧糖剥夺8 h，复氧12 h后，吸取上清20 ul检测LDH释放量，向贴壁细胞的96孔板中加入CCK-8试剂测定细胞活性，贴壁细胞经消化后采用流式细胞仪检测细胞凋亡。（2）GSRd作用机制的探索。实验分为6组：正常组、OGD组、OGD+GSRd1 uM组、OGD+GSRd1 uM+2-ME2组、OGD+GSRd1 uM+雷帕霉素组、OGD+GSRd1 uM+LY294002组。OGD8 h复氧12 h后，分别提取细胞总蛋白或核蛋白，通过Western blot检测VEGF、p-mTOR、p-AKT或Hif-1α的表达。
　　结果：（1）OGD后细胞存活明显减少，细胞毒性和细胞凋亡明显增加（P<0.05，OGD组 vs.正常培养组）；1 uM和5 uM的GSRd干预后细胞存活均明显提高，毒性显著降低，凋亡明显减少（P<0.05，GSRd1或5 uM组 vs. OGD组），5 uM组和1 uM组之间无差别（P>0.05），而10 uM的GSRd干预后细胞存活却明显降低、凋亡比例显著上升（P<0.05，OGD+GSRd10 uM vs. OGD+GSRd1 uM）。（2）正常培养的细胞可表达VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT，OGD后VEGF、Hif-1α、p-mTOR和p-AKT的表达均明显降低（P<0.05，OGD组 vs.正常培养组）；1 uM GSRd干预后上述因子的表达明显增高（P<0.05，GSRd1 uM组 vs. OGD组）；分别加入Hif-1α抑制剂2-ME2、mTOR抑制剂雷帕霉素和AKT抑制剂LY294002后，Hif-1α和VEGF的表达均被明显抑制（P<0.05，OGD+GSRd+抑制剂组 vs. OGD+GSRd组），雷帕霉素可显著抑制 p-mTOR的表达但不能抑制其上游信号通路中 p-AKT的表达， LY294002则可同时抑制p-AKT及其下游p-mTOR、Hif-1α和VEGF的表达。
　　结论：在体外，GSRd促进血管发生的作用可能与AKT-mTOR-Hif-1α-VEGF信号通路的激活相关。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一 缺血性脑卒中概述

二 脑梗死后血管发生的研究进展

三 人参皂甙Rd的研究进展

实验一 人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的影响

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4讨论

实验二 人参皂甙Rd对成年大鼠脑梗死后血管发生的机制研究

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 GSRd对体外培养人脐静脉微血管内皮细胞（HUVECs）的作用

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢