EPCs与BMSCs复合细胞膜片促进放疗区种植体骨结合的实验研究

摘要

【背景与目的】
　　头面部恶性肿瘤患者，通常需要采用手术联合放疗的治疗方案。术后软硬组织的缺损修复一直是颌面修复的难题。种植体技术的出现，为颅颌面缺损修复提供了良好的固位和支持，同时也是修复牙列缺损或缺失的重要手段。但是，临床研究证明放疗会明显降低种植体成功率，破坏种植体周围骨组织的成骨活性和微循环。目前，使用高压氧治疗来提高放疗区种植体骨结合在临床上已得到应用，但其有效性颇具争议。国内外也有研究者尝试采用种植体表面处理来解决这一问题，但未形成有效的解决方案。本课题组前期提出了应用骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells，BMSCs）膜片进行种植体表面修饰，体外构建组织工程化种植体，利用细胞膜片促进种植体周围骨组织再生及骨结合。后期研究发现单纯利用BMSCs很难在放疗区维持成骨持续性和促进微血管再生。目前的研究发现血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)能通过参与血管构建或旁分泌作用促进血管再生，已应用于多种组织缺血模型的修复，在构建血管化组织工程骨中也得到了应用。基于以上分析，本课题拟采用EPCs和BMSCs构建复合细胞膜片种植体复合物，通过研究其体外成骨分化能力和异位成骨能力，以及植入放疗动物模型后骨结合形成能力，探讨应用EPCs和BMSCs复合细胞膜片提高放疗区种植体骨结合的可行性。
　　【方法】
　　1.采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，鉴定其成骨、成脂分化能力和细胞表型。采用差速贴壁法、密度梯度离心法分离培养大鼠EPCs，检测细胞表型、Weible-Palade小体，鉴定管腔形成、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。
　　2.按不同比例对BMSCs和EPCs进行直接共培养，根据成骨相关基因及血管内皮生长因子（VEGF）表达量筛选共培养比例。按所选比例培养复合细胞膜片。
　　3.细胞膜片与种植体材料复合，使用扫描电镜观察表面形貌。将细胞膜片-种植体复合物成骨诱导5天后，采用碱性磷酸酶、天狼星红、茜素红染色、Real-time PCR和Western blot，检测其体外成骨活性。
　　4.将细胞膜片-种植体复合物移植于裸鼠皮下，8周后取材，采用Micro-CT和硬组织切片染色检测复合细胞膜片种植体复合物的异位成骨能力。
　　5.建立大鼠胫骨放疗模型，在大鼠胫骨干骺端植入种植体。植入8周后取材，采用Micro-CT和硬组织切片染色观察复合细胞膜片对骨结合的影响，取种植体周围骨质进行Real-time PCR检测成骨相关基因及VEGF的表达。
　　【结果】
　　1.BMSCs和EPCs符合各自特征。BMSCs具有成骨、成脂分化能力，表面分子CD29、CD90、CD105表达阳性，CD34、CD31表达阴性。EPCs表面分子CD31、CD144和 VEGFR2表达阳性，胞内可见Weible-Palade小体，具有管腔形成、吞噬Dil-Ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。
　　2.在本实验选择的共培养比例中，EPCs与BMSCs按比例为10：1共培养时成骨相关基因及VEGF表达量较高。EPCs与BMSCs共培养并进行成膜诱导可形成复合细胞膜片。复合细胞膜片能贴附并生长于种植体材料表面。
　　3.BMSCs、EPCs复合细胞膜片与种植体复合后经过成骨诱导，茜素红染色较深，Real-time PCR检测成骨相关基因及VEGF表达量较高，Western blot检测成骨相关蛋白表达较高。
　　4.在异位成骨实验中，Micro-CT、VG染色显示复合细胞膜片-种植体复合物周围有新生骨质生成，优于其他组。
　　片组种植体周围骨质形成优于其他组，种植体周围骨组织成骨相关基因及VEGF的表达量高。
　　【结论】
　　1.EPCs与BMSCs按比例为10：1共培养，成骨相关基因及VEGF表达量较高，可用于构建复合细胞膜片。
　　2.BMSCs、EPCs复合细胞膜片可在种植体表面贴附生长并具有良好的体内、外成骨能力，可用于促进种植体周围成骨。
　　3.BMSCs、EPCs复合细胞膜片可用于改善放疗区种植体周围的成骨能力，促进种植体骨结合。

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文献回顾

一、放疗影响种植体骨结合的研究进展

1种植体骨结合

二、骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞的研究进展

2.1 BMSCs的研究进展

2.2 EPCs的研究进展

2.3 EPCs与BMSCs的联系与相互作用

2.4 EPCs、BMSCs共培养在成骨相关领域的研究进展

2.5 BMSCs细胞膜片及膜片血管化的研究进展

第一部分 大鼠BMSCs和EPCs复合细胞膜片的构建

实验一 大鼠BMSCs分离培养及鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二 大鼠EPCs分离培养及鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验三BMSCs、EPCs复合细胞膜片的构建

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分BMSCs、EPCs复合细胞膜片种植体复合物成骨能力的研究

实验一BMSCs、EPCs复合细胞膜片种植体复合物体外成骨能力的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二BMSCs、EPCs复合细胞膜片种植体复合物体内成骨能力的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分BMSCs、EPCs复合细胞膜片对放疗区骨结合的影响

实验一 大鼠胫骨放疗模型的建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二BMSCs、EPCs复合细胞膜片促进放疗区骨结合的研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

全文总结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢