耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

摘要

目前耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)已成为临床感染的主要病原菌，对动物食品安全造成污染，并且严重威胁人类健康。为了检测MRS的流行情况，本研究人工表达了耐甲氧西林蛋白PBP2a，并制备了单克隆抗体及多克隆抗体，在此基础上，建立了检测MRS的双抗夹心ELISA方法。 将针对耐甲氧西林蛋白PBP2a的原核重组表达载体pGEX-6p-1-Tpase经双酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21，在最佳诱导条件下(0.8 mM IPTG诱导4h)诱导蛋白表达，蛋白大小为66KD。SDS-PAGE电泳检验所表达蛋白为包涵体形式，将包涵体超声破碎并进行复性和纯化，测得纯化后蛋白浓度为0.3mg/mL。 用纯化后的融合蛋白按照常规免疫程序免疫家兔制备多克隆抗体，经琼脂双向双扩散试验测得多克隆抗体的效价为1∶8以上;用纯化后的融合蛋白免疫小鼠后制备了单克隆抗体3E10、4D8、1C12、3C2，这四株细胞重链的亚型是IgG1，轻链是Kappa。 用制备好的针对耐甲氧西林蛋白PBP2a的单克隆抗体和多克隆抗体建立双抗夹心ELISA用以检测MRS，选择1∶12800稀释比例的多克隆抗体包被酶标反应板，用PBP2a重组蛋白作为检测抗原，选择1∶10000稀释比例的单克隆抗体作为检测抗体，酶标抗体浓度为1∶10000，建立双抗夹心ELISA;建立的检测方法的灵敏度为1×105cfu/mL。用建立的双抗夹心ELISA方法检验临床分离的47株葡萄球菌，并用Dot-ELISA检验其准确率，符合率为82.98％。

目录

论文说明

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摘要

第一章 文献综述

1 引言

2 MRSA的流行状况

3 MRSA筛选的指征和方法

4 MRSA的实验室诊断及隔离、治疗措施

5 对于MRSA患者的国家政策

6 MRSA流行的预测

7 中国的MRSA流行及相关控制措施

8 本研究目的及意义

第二章 试验研究

试验一 耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a蛋白的表达与纯化

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验二 耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a蛋白多克隆抗体及单克隆抗体的制备

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

试验三 双抗夹心ELISA的建立及初步应用

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

总结

参考文献

英文缩略词表

导师组意见

致谢

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