EPA对E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接蛋白的影响及其抗炎作用的初步研究

摘要

【研究目的】
　　肠上皮细胞间的紧密连接是构成肠上皮屏障的重要结构基础，在调节物质跨细胞旁路转运中发挥着重要的作用。正常生理情况下，紧密连接是完整的，当紧密连接结构受损时，可引起肠壁通透性增高、毒性物质通过及微生物移位，激活肠黏膜免疫系统，导致炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）及全身炎症反应等，而多数用于治疗肠道疾病的药物是通过恢复正常的肠黏膜通透性起作用。因此，维持完整的肠屏障功能对于维护人体健康至关重要。
　　目前已有多项研究证实，炎症性肠病患者肠道中黏附侵袭性大肠杆菌（adherent-invasive Escherichia coli，AIEC）明显多于对照组。二十碳五烯酸（eicosapentaen oic acid，EPA）能有效预防紧密连接结构的破坏，并具有抗炎作用，而关于EPA对细菌感染引起的肠屏障功能下降的影响，仍有待进一步研究。人结肠癌细胞株Caco-2细胞，在正常培养条件下，能分化并融合成连续的单层细胞，具有类似于肠上皮细胞的功能和结构。因此，本研究以 EPA和（或）E.coli LF82菌种作用于 Caco-2细胞，通过RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测紧密连接蛋白ZO-1的表达情况；通过酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中炎症因子TNF-α、INF-γ分泌量的变化情况，初步探讨EPA对E.coli LF82感染后细胞紧密连接蛋白的保护作用及机制，为阐明E PA对肠上皮屏障损伤相关的胃肠道疾病的保护作用提供理论依据。
　　【研究方法】
　　1.采用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞紧密连接模型，通过显微镜观察细胞的形态学特点，MTT法测定细胞的生长曲线，通过比较细胞膜两侧碱性磷酸酶（ALP）活性等指标对Caco-2细胞模型进行评价，采用RT-qPCR研究E.coli LF82对细胞间紧密连接ZO-1的影响，通过 ELISA研究 E.coli LF82对细胞培养上清中炎症细胞因子的影响；
　　2.用EPA对体外肠上皮屏障进行干预，采用MTT及流式细胞术检测不同浓度EPA对Caco-2细胞存活率及凋亡率的影响，以确定EPA对Caco-2细胞的安全浓度，通过RT-qPCR检测EPA对紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的影响，进一步确定EPA起保护作用的最低有效浓度；
　　3.探讨EPA对E.coli LF82作用的影响及可能机制，通过RT-qPCR和western blot检测EPA对E.coli LF82处理后紧密连接蛋白ZO-1表达的影响，ELISA检测EPA对E.coli LF82处理后培养上清中炎症因子TNF-α、INF-γ分泌量的影响，证实EPA对 E.coli LF82感染后肠上皮屏障紧密连接蛋白的保护作用及可能机制。
　　【研究结果】
　　1.来源于结肠癌的Caco-2细胞在培养21天后，在体外能有效模拟肠上皮屏障的生理状态，E.coli LF82可下调肠上皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1mRNA的表达量，并且增加肠上皮细胞屏障炎症细胞因子TNF-α、INF-γ的分泌；
　　2. MTT和流式细胞术检测结果显示，25、50μmol/L的EPA可显著增加Caco-2细胞存活率，并呈浓度依赖性；100、200μmol/L EPA对Caco-2细胞增殖有明显抑制效应，并呈浓度依赖性。EPA浓度为0、25、50、100、200μmol/L时，细胞凋亡率随EPA浓度的增加而增加，而EPA浓度为25、50μmol/L时，细胞凋亡率与对照组（0μmol/L）差异无统计学意义，EPA浓度为100、200μmol/L时，细胞凋亡率较对照组（0μmol/L）明显增加，且50μmol/L的 EPA有上调紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的作用；
　　3. EPA能上调E.coli LF82感染后肠上皮屏障紧密连接蛋白ZO-1的表达，有效预防肠上皮细胞间紧密连接的损伤，EPA可降低E.coli LF82感染后肠上皮屏障炎症细胞因子 TNF-α、INF-γ的分泌，抑制感染诱导的炎症因子的分泌，缓解炎症因子对紧密连接的损伤。
　　【研究结论】
　　我们的研究发现小剂量EPA能诱导Caco-2细胞增殖，而大剂量EPA能诱导细胞凋亡；E.coli LF82可降低Caco-2细胞之间紧密连接蛋白ZO-1的表达，并刺激细胞分泌炎症因子；EPA能有效预防E.coli LF82感染后肠上皮细胞紧密连接的损伤，并抑制E.coli LF82感染诱导的炎症因子的分泌，且呈浓度依赖性。以上研究结果提示：EPA可能通过抑制E.coli LF82感染后炎症因子的分泌对肠黏膜屏障起保护性作用，推测补充适当浓度的EPA可能具有预防感染诱导的肠道炎症反应和肠黏膜屏障损伤的作用，可以通过动物实验进一步研究论证。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1. 肠上皮屏障功能异常是肠道疾病发病的关键环节

2. 紧密连接是构成肠上皮屏障的重要结构基础

3. 肠道细菌可影响紧密连接蛋白的完整性

4. AIEC菌株E.coli LF82 可诱导肠黏膜屏障炎症损伤

5. EPA对紧密连接起保护性作用

6. 本课题的研究设想

第一部分 E.coli LF82对体外肠上皮屏障的影响

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 不同浓度EPA对体外肠上皮屏障模型的影响

引言

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 EPA对E.coli LF82感染后Caco-2细胞间紧密连接的影响及机制

引言

1材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢