巨噬细胞ly6Chigh向ly6Clow亚群转变在肝损伤修复中的调控作用与机制研究

摘要

各种致病因素导致的肝损伤修复是一个多细胞参与的炎症反应过程。体现在肝脏实质细胞变性、凋亡和坏死，和肝非实质细胞活化。长期慢性损伤引起肝脏胶原纤维沉积导致肝纤维化-肝硬化形成，而急性大量肝细胞损伤坏死则导致急性肝衰竭。肝硬化和肝衰竭都是临床上常见而且严重威胁人类健康的疾病。巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分，在肝损伤修复过程中，发挥着双重调控作用。研究表明，对肝脏巨噬细胞的有效干预可以影响肝损伤修复过程。因此，针对于肝损伤中巨噬细胞的作用和功能的研究可能为治疗各种肝脏疾病提供新靶点。
　　肝脏巨噬细胞根据其起源和功能可以分为不同亚群，它们在肝损伤修复中发挥不同的功能。受到损伤因素刺激后，肝脏定居型巨噬细胞凋亡坏死，骨髓来源巨噬细胞向肝脏浸润。后者表现很强的功能异质性，在肝损伤的不同阶段，可以分为ly6Chigh（ly6Chi）和ly6Clow（ly6Clo）两个不同功能状态的亚群，ly6Chi巨噬细胞表现为促炎促损伤的作用，而ly6Clo巨噬细胞则表现为促纤维降解和促修复作用，因此肝脏中lyChi/ly6Clo比例可以作为评价肝脏巨噬细胞整体功能的重要指标。研究表明，ly6Clo可能是由ly6Chi细胞转变而来的，但调控机制仍有待深入研究。因此，研究肝损伤修复中巨噬细胞ly6Chi向ly6Clo亚群转变的作用和分子机制，对靶向不同巨噬细胞亚群进行肝病治疗具有重要意义。
　　我们之前的研究表明，回输M1型巨噬细胞可以显著地减轻小鼠肝脏纤维化，与肝内巨噬细胞数量增加和肝内基质金属蛋白酶表达上调相关。然而，M1回输减轻肝纤维化是否与肝内巨噬细胞ly6Chi向ly6Clo亚群转变相关，其可能的机制是什么，仍需要进一步的研究。
　　Notch信号在进化上高度保守，参与多种细胞命运选择，在髓系细胞的发育、分化和功能调节上均发挥着重要调控作用。近期大量研究和我们的前期工作均表明，活化的巨噬细胞表达Notch信号途径的多种分子，并且Notch信号可以参与巨噬细胞活化模式的调控。此外，Notch信号还可以通过CYLD-NFκB信号参与巨噬细胞激活和功能的调控进而影响肝纤维化进程。那么Notch信号是否参与肝脏巨噬细胞ly6Chi向ly6Clo亚群转变，是否可作为靶向肝脏巨噬细胞亚群治疗肝纤维化的靶点，是亟待解决的问题。
　　因此，针对上述问题，开展了以下研究：
　　1.建立不同极化类型巨噬细胞回输治疗四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型，利用TUNEL和免疫荧光等方法研究细胞回输对纤维化肝脏星形细胞凋亡的诱导作用；
　　2.FACS分析肝脏非实质细胞，检测不同极化类型巨噬细胞回输后对肝脏免疫细胞亚群的影响；
　　3.免疫磁珠分选技术获得回输后肝纤维化小鼠肝脏巨噬细胞，实时定量PCR方法检测肝纤维化相关指标的变化；
　　4.免疫组化和生化检测，观察细胞回输后肝脏细胞增殖和肝功能变化；
　　5.利用CCR2敲除小鼠和氯膦酸盐脂质体清除实验，研究M1型细胞回输调控肝脏微环境不同来源巨噬细胞的作用。
　　6.在髓系RBP-J敲除小鼠上建立肝纤维化模型，FACS检测肝脏髓系细胞亚群的变化；
　　7.在野生小鼠上建立肝切后再生模型，利用免疫染色、FACS等研究肝再生过程中巨噬细胞亚群的变化；
　　8.在髓系RBP-J敲除小鼠上建立肝切后再生模型，利用免疫组化染色、FACS等研究髓系Notch信号阻断对肝再生的影响。
　　结果：
　　1.回输M1型巨噬细胞促进肝脏NK细胞数目增多和活性增强，促进肝脏TRAIL分子的表达，诱导HSC凋亡，进而减少肝脏胶原产生；
　　2.促进自体巨噬细胞向纤维化肝脏募集，并促进肝脏巨噬细胞由ly6Chi向ly6Clo亚群转变，使得促纤维消融巨噬细胞亚群数量增多，增加肝脏胶原降解；
　　3.通过促进纤维化小鼠肝细胞增殖，促进肝脏损伤修复，进而缓解纤维化；
　　4.回输的M1型巨噬细胞维持其M1表型，但数量逐渐减少，提示细胞回输对微环境的改变主要发生于回输早期；
　　5.在肝纤维化模型中，发现髓系细胞Notch信号阻断促进巨噬细胞由ly6Chi向ly6Clo亚群转变，可能是减轻肝脏纤维化的细胞学机制；
　　6.在肝切除再生中，伴随着巨噬细胞亚群的变化，发现巨噬细胞由ly6Chi向ly6Clo亚群转变可能参与肝再生的调控。进一步利用转基因小鼠肝再生模型发现，髓系细胞Notch信号阻断促进巨噬细胞ly6Chi向ly6Clo亚群转变，可能参与肝再生过程中血管内皮细胞增殖的调控。
　　综上所述，ly6Clo巨噬细胞在肝损伤再生修复中发挥重要作用，髓系细胞Notch信号缺失可能促进ly6Chi巨噬细胞亚群向ly6Clo转变，从而减轻肝纤维化，促进肝再生。然而，在肝损伤修复中Notch信号调控其转变的详细机制仍有待于进一步研究。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

第一部分 肝损伤修复

第二部分 肝脏巨噬细胞

第三部分 Notch信号通路

实验一 肝内巨噬细胞亚群转变是介导M1型巨噬细胞回输治疗小鼠肝纤维化的主要机制

1实验材料及仪器

2实验方法

3 实验结果

4讨论

实验二 Notch信号通路参与调控巨噬细胞亚群转变影响肝脏损伤再生研究

1 实验材料及仪器

2方法

3实验结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢