丹参-降香对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制的代谢组学研究

摘要

背景：
　　缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD）是世界公共卫生关注的重大问题，具有发病率高和死亡率高的特点。缺血后的主要治疗策略是及时恢复血供，但血液再灌注会加重缺血所致的心肌细胞损伤及心脏功能障碍，故预防和处理心肌缺血/再灌注（myocardial ischemia/reperfusion，MI/R）损伤是治疗IHD的重要手段。
　　与西药相比，中药（traditional Chinese medicine，TCM）更注重采用整体和协同的方法恢复机体阴阳能量平衡。其中丹参（Salvia Miltiorrhiza，SM）-降香（Dalbergia Odorifera，DO）或以该对药为主要组成的方剂治疗IHD疗效明确，前景广阔，千百年来在我国和日本、韩国民间一直沿用。但是由于SM-DO的药效物质不明确、配伍使用的科学内涵和作用机制不清楚，导致SM-DO及其组成方剂的国际推广和二次开发陷入困境。
　　代谢组学是一门能快速阐明中药多组分如何通过多器官、多系统、多靶点实现整体作用的组学技术，其全景式、综合性、整体互动性与中药整体调节特点及中医药理论的整体观、辨证论治不谋而合。代谢组学为中药药效评价及作用机制研究提供了强有力的技术支撑，有助于系统、深刻地揭示中药配伍的科学内涵，有助于全面、深入地传承和发展中医药理论。
　　目的：
　　1.研究丹参水提物（aqueous extract of Salvia Miltiorrhiza，SM）、降香水提物（aqueous extract of Dalbergia Odorifera，DOA）、降香挥发油（volatile oil of Dalbergia Odorifera，DOO）、SM+DOA和SM+DOO对大鼠MI/R损伤的保护作用。
　　2.基于代谢组学技术寻找SM+DOO治疗MI/R损伤的生物标志物，分析SM+DOO保护心肌的作用机制。
　　3.对SM+DOO心肌保护的作用机制进行反馈验证。
　　方法：
　　1.将80只SD大鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（Model）组、地尔硫卓（Diltiazem）组、SM组、DOA组、DOO组、SM+DOA组和SM+DOO组，每组10只，灌胃给药7 d后结扎大鼠冠状动脉左前降支（left anterior descending，LAD），行缺血30 min再灌注180 min手术复制MI/R损伤模型，观察给药后大鼠心电图ST段和心率变化，测量心肌梗死面积，观察心肌损伤病理形态，检测大鼠血清肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）、肿瘤坏死因子-α（ tumor necrosis factor， TNF-α）及白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，检测大鼠血清和心肌组织超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，检测大鼠心肌细胞凋亡情况。
　　2.基于气相色谱-飞行时间-质谱（ gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）代谢组学技术对Sham组、Model组和SM+DOO组大鼠血清进行检测，将获得的原始数据进行数据预处理，再借助 SMICA14.1软件对数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判别分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonalpartial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元统计分析，全面评价SM+DOO对大鼠MI/R损伤治疗效果。通过两两比较的OPLS-DA结果，结合变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值及t检验结果，筛选出潜在的生物标志物，并通过MetaboAnalyst3.0软件进行代谢通路分析。
　　3.检测能量代谢相关的生化指标乳酸（lactic acid，LD）、非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acid，NEFA）、柠檬酸合成酶（citroyl synthetase，CS）、乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，AcCoA）/辅酶 A（coenzyme A，CoA）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、Na+K+-ATP酶、Ca++-ATP酶及Ca++Mg++-ATP酶的含量，并采用皮尔森相关分析法将这些能量代谢相关的生化指标和代谢组学筛选出的生物标志物进行关联，以探索两者之间的内在联系，验证 SM+DOO对大鼠 MI/R损伤的保护作用；此外，通过Western Blot检测能量代谢相关的单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、肉毒碱棕榈酸转移酶-1（carnitine palmitoyl transterase-1， CPT-1）、丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）及丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）的蛋白表达水平，验证SM+DOO对大鼠MI/R损伤保护的作用机制。
　　结果：
　　1.各给药组对大鼠心肌损伤都有着不同程度的改善作用，其中SM+DOO可改善大鼠心电图，降低心肌梗死面积，改善心肌组织的病理损伤，减少CK-MB、LDH释放，抑制MI/R损伤引起的氧化应激和炎症反应，减少心肌组织凋亡，且与SM组相比，差异具有统计学意义。
　　2. PCA、PLS-DA结果显示Sham组、Model组、SM+DOO组代谢物集散区域能较好分离，且SM+DOO组较Model组更加接近于Sham组，说明SM+DOO可改善大鼠MI/R损伤。OPLS-DA结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠血清中乳酸、3-羟基丁酸、磷酸、未知物、棕榈油酸、十七酸、硬脂酸和花生四烯酸水平升高，而苹果酸、柠檬酸、肌酸和苯丙氨酸水平降低，提示这12种内源性物质为MI/R损伤的潜在生物标志物。这些内源性物质在SM+DOO组大鼠体内得到了不同程度的恢复，其中3-羟基丁酸、柠檬酸、棕榈油酸、十七酸、花生四烯酸回调水平与Model组相比，具有统计学差异。代谢通路分析表明SM+DOO通过降低大鼠体内花生四烯酸、十七酸、棕榈油酸、硬脂酸及3-羟基丁酸含量，抑制心肌对脂肪酸的摄取和氧化；通过增加三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环中苹果酸、柠檬酸及苯丙氨酸（生成延胡索酸，参与TCA循环）含量，增加心肌对葡萄糖的氧化利用，改善能量代谢，发挥心肌保护作用。
　　3.生化指标检测结果与代谢组学检测结果相一致，分别从经典药理学和系统生物学角度验证了SM+DOO对心肌的保护作用；Western Blot实验发现SM+DOO通过调控AMPK/ACC/CPT-1通路抑制脂肪酸氧化、调控PDK/PDC通路促进葡萄糖氧化，从而减少心肌氧耗，改善能量代谢，最终发挥心肌保护作用。
　　结论：
　　SM、DO及SM-DO均具有心肌保护作用，且SM+DOO效果最优，提示SM与DOO之间存在协同作用，推测 DOO通过发挥“芳香上窜、引药上行”功效，增强SM治疗效果。代谢组学结果显示MI/R损伤模型建立成功，SM+DOO治疗有效，并筛选出12个与MI/R损伤相关的生物标志物，而SM+DOO主要是通过调节TCA循环和脂肪酸β氧化代谢水平，改善心肌能量代谢。此外，经验证 SM+DOO可调控AMPK/ACC/CPT-1、PDK/PDC这两条主要能量代谢信号通路，从而发挥心肌保护作用，与代谢组学分析结果相一致。通过本课题的研究，对SM-DO治疗 IHD的整体药效和作用机制有了更深入的认识，为代谢组学技术应用于中药复方研究奠定了坚实的实验基础。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1 中药防治心肌缺血/再灌注损伤的作用机制

2 丹参-降香防治心血管疾病的研究进展

3 代谢组学的技术关键及其在中药治疗心血管疾病研究中的应用

第一部分 丹参-降香对大鼠MI/R损伤的保护作用

1 仪器与材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 丹参-降香对大鼠MI/R损伤保护机制的代谢组学研究

1 仪器与材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 丹参-降香对大鼠MI/R损伤保护机制的反馈验证

1 仪器与材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢