姜黄素对猪AMSCs成脂分化及KLF2转录因子表达模式的影响

摘要

研究脂肪细胞分化的分子机制，关系到人类肥胖的防治策略。本研究主要利用细胞培养、诱导分化、流式细胞仪、荧光实时定量PCR等技术，分离培养了猪脂肪间充质干细胞（AMSCs），对其进行细胞表面抗原鉴定，然后进行成脂诱导分化，并对成脂分化过程中Krüppel样因子2（KLF2）的表达模式进行了检测，在此基础上检测分析了姜黄素对猪AMSCs增殖、诱导分化、以及KLF2表达模式的影响，获得了如下结果：
　　1.猪AMSCs的分离培养和鉴定
　　采集猪颈背部脂肪组织，经 I型胶原酶消化，再经原代和传代培养获得 AMSCs。选择 F3代细胞，用流式细胞仪检测细胞表面抗原。结果显示，间充质干细胞表面抗原CD29、CD44和CD105表达量分别为91.7％、95.1%和95.6%，而造血干细胞表面抗原CD34表达量仅为3.39%。这些结果表明，本研究所获得的AMSCs纯度较高。AMSCs的生长动力学检测显示，各代传代细胞都呈现出典型的―S‖型生长曲线，在增殖速度上无显著差异。
　　2.猪AMSCs的成脂诱导分化及KLF2的表达模式
　　取 F4代 AMSCs在成脂诱导培养基中诱导分化，用形态学和油红 O染色法鉴定AMSCs的成脂分化程度，用实时荧光定量PCR检测KLF2的表达模式，并与过氧化物酶体增殖物激活受体2(PPARγ2)的表达模式进行比较。在诱导分化2天后，个别细胞质中出现小脂滴，且含脂滴的细胞数量和脂滴量随诱导时间的延长而增加。诱导分化第18天，成脂分化率达48.2%。在诱导分化第2、8和16d，KLF2的表达量分别为1.84±0.206、1.07±0.072、0.83±0.095，而PPARγ2 mRNA的表达量分别为3.06±0.542、13.22±0.5736、15.11±1.073。这些结果表明，猪 AMSCs具有良好的成脂分化潜能，KLF2的表达量在成脂分化早期的前脂肪细胞阶段增加，成脂分化开始后逐步减少，证明KLF2是维持前脂肪阶段的重要转录因子。
　　3.姜黄素对猪AMSCs增殖的影响
　　取F5代猪AMSCs，用含1、5、10、15、20和25μM的姜黄素培养液进行培养，分别于1、3、5、7、9 d进行了MTT比色检测。结果显示，1μmol/L浓度姜黄素在细胞培养第5至9天，能够显著促进细胞增殖（P＜0.05），5μmol/L浓度姜黄素在细胞培养第3天开始显著抑制细胞增殖（P＜0.05），而高于10μmol/L浓度姜黄素则在细胞培养第1天就显著抑制细胞增殖（P＜0.05）。这些结果表明，低浓度姜黄素具有促进AMSCs增殖作用，而高浓度姜黄素则抑制猪AMSCs的增殖。
　　4.姜黄素对猪AMSCs成脂分化的影响
　　取 F5代猪 AMSCs，当细胞汇合度达80%时，分别用含0、1、5、10、15、20和25μM的姜黄素成脂诱导液作用24 h，然后置换成脂诱导液诱导分化，在诱导第10 d用油红O染色提取法检测细胞内脂肪含量。结果显示，所用1至25μM姜黄素均能显著抑制（P＜0.05）细胞的成脂分化，用1μmol/L获得5.36%的抑制率，而用25μmol/L获得68.19%的高抑制率。因此，将25μM姜黄素作为抑制脂肪细胞分化的最佳浓度。
　　5.姜黄素对猪AMSCs成脂分化过程中KLF2和PPARγ2表达模式的影响
　　取F5代细胞，用含25μM姜黄素的成脂诱导液作用24 h，然后换成成脂诱导液，在诱导第2、8和16 d，用Real-timePCR检测了姜黄素对成脂分化关键基因KLF2和PPARγ2 mRNA表达的影响。结果显示，姜黄素显著上调了各检测时间点的KLF2 mRNA的表达，上调率分别达到48.37%、20.56%和9.64%；但抑制了相应检测时间点的PPARγ2 mRNA的表达，下调率分别达到16.01%、35.93%和27.27%。这些结果表明，姜黄素能够上调KLF2 mRNA的表达，且在成脂分化的前脂肪细胞阶段作用最大，随分化时间的延长作用减弱；相反，姜黄素能够下调PPARγ2mRNA的表达，且在分化的早中晚期下调作用都非常明显，姜黄素对猪AMSCs成脂分化的抑制作用是通过上调KLF2和下调PPARγ2 mRNA的表达而实现的。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

第一部分 文献综述

1 脂肪细胞的分化研究及调控

2 脂肪间充质干细胞的研究进展

3 姜黄素的研究进展

第二部分 猪AMSCs的分离和培养

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 猪AMSCs的成脂诱导分化

1 材料与方法

2结果

3 讨论

第四部分 姜黄素对猪AMSCs增殖和成脂分化的影响

1 材料和方法

2结果

3 讨论

结论

参考文献

导师组意见

致谢

个人简历