马铃薯病毒快速检测体系的建立及马铃薯BRP1基因dsRNA的体外表达

摘要

马铃薯病毒是造成马铃薯种质退化的主要原因，可造成马铃薯产量降低和品质下降。侵染马铃薯的植物病毒有40多种，其中PVY、PVS、PVM、PLRV等在田间生产中普遍发生，严重影响了马铃薯生产。目前，国内外主要通过生产马铃薯脱毒种薯来解决种质退化问题，这使马铃薯脱毒材料及种薯的病毒检测显得尤为重要，由此建立一套快速、有效的病毒检测方法迫在眉睫；PSTVd很难通过茎尖脱毒去除，通过PSTVd结合蛋白探究其在寄主体内的复制侵染是防控PSTVd的一个新思路。基于此，本研究开展了马铃薯主要病毒检测方法和PSTVd结合蛋白相关基因的dsRNA研究，主要取得结果如下：
　　1.克隆了青岛地区ToCV和PVM的CP基因，其核苷酸序列全长分别为774bp、915bp。Blast比对结果显示，ToCV青岛分离物与各分离物间CP基因序列的相似性为97.2％-99.6%，推导的氨基酸序列的相似性为97.3%-100%；PVM青岛分离物与各分离物间CP基因序列的相似性为79.0%-95.5%，推导的氨基酸序列相似性为84.5%-97.7%。
　　2.以感染PSTVd的植株总RNA作为模板，比较了一步RT-PCR方法与两步RT-PCR方法，表明一步RT-PCR检测技术具有快捷、简便、减少污染等优点。以此为基础，建立了马铃薯5种主要病毒（PVS、PLRV、PVY、PVM和ToCV）和1种类病毒（PSTVd）同时检测鉴定的一步六重RT-PCR技术，扩增得到目的条带大小分别为932bp、781bp、628bp、534bp、229bp和359bp。
　　3.克隆了PSTVd的马铃薯结合蛋白BRP1蛋白基因，ORF全长1809bp，含有191bp内含子，推导的氨基酸序列全长为602aa。其与番茄同源蛋白Virp1的氨基酸序列相似性在98%以上，其中核定位信号区域为100%、bromodomain结构域为97%、RNA结合区域为93%；构建了针对BRP1蛋白基因的1217bp BRP11的dsRNA原核表达载体和548bp BRP12的dsRNA体外转录体系，通过体外转录方法分别获得了1217bp和548bp的dsRNA。稳定性试验表明，得到的dsRNA比较稳定，可用于后期试验。
　　研究结果为马铃薯种薯病毒的快速检测鉴定提供了技术支撑，为马铃薯纺锤块茎类病毒的有效防治奠定了理论基础。