单唾液酸四己糖神经节苷脂在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的作用

摘要

目的：近年来研究表明骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)可以体外诱导分化为神经细胞，因此BMSCs有望成为神经细胞移植的种子细胞来治疗神经系统疾病，但BMSCs定向诱导分化率低，且分化后的细胞存活时间短而不能有效增殖以满足移植的需要。如何能够找到稳定高效的诱导方法及提高诱导后神经细胞的存活率是需要解决的一个关键问题。单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1)在神经细胞的发育、分化、修复和信号转导中有相当重要的作用。研究表明，GM1有诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用，本文就不同浓度GM1对BMSCs的诱导分化作用作一探讨。 方法：以全骨髓培养法分离成人BMSCs，进行原代和传代培养。用流式细胞仪检测BMSCs表面CD44，CD45，CD90，CD105的表达以鉴定纯度。以含有10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1的DMEM无血清培养基诱导第五代的BMSCs，阴性对照组不加任何诱导剂。至诱导后7d观察细胞形态变化并计数，诱导后6h以免疫细胞化学法测定各组细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特异性微管相关蛋白(MAP-2)，以鉴定是否诱导为神经元样细胞并计算分化百分率。各组间分化百分率进行比较和统计学处理。并用MTT法测定诱导后0.5h、6h、24h、3d细胞生长状况。 结果：细胞接种2天后给予PBS冲洗，全量换液可见贴壁细胞呈集落状生长。8～10天后细胞可基本铺满瓶底，为均一梭状细胞。以1：3比例传代，传代后1天左右细胞可以恢复活力并贴壁生长，5～6天后可铺满瓶底。传代至4～5代时细胞形态比较均一，混杂细胞较少。流式细胞术检测细胞表面标志CD44(+)，CD90(+)，CD105(+)，CD45(—)，基本证实BMSCs的纯度。BMSCs经预诱导后，细胞体积增大，形态变长。加入诱导液30～40 min后，细胞开始发生形态变化，胞体向内收缩，呈球形或圆形，并向周围长出突起，有立体感，折光性增强；诱导4 h后，细胞形态发生明显改变，胞体进一步收缩形成突起，胞体立体感增强，周围出现光晕，可见到很多双极和多极细胞；6 h后大多数细胞形成锥形、三角形等不规则形状，突起增多变长，细胞间突起相互连接，交错成网，呈现典型的神经细胞样形态。到诱导后3天，神经元样细胞增多不明显。5天后有少量细胞悬浮死亡，突起延长多交织成网状；7天时细胞形态与5天时基本相同，但悬浮死亡细胞较多。阴性对照组细胞仍呈均一长梭状细胞，但细胞生长速度明显减慢。细胞诱导6 h免疫细胞化学检测不同浓度GM1组和阴性对照组细胞均有MAP-2，NSE表达，但未检测到GFAP的表达。10μg/ml、60μg/ml、90μg/ml GM1组NSE、MAP-2细胞阳性率均较阴性对照组明显高(P＜0.05)。组间比较：60μg/ml、90μg/ml组NSE、MAP-2细胞阳性率均较10μg/ml组高(P＜0.05)，60μg/ml、90μg/ml组细胞阳性率差异不显著(P＞0.05)。MTT结果显示经GM1诱导后的神经元样细胞比阴性对照组生长状态好。 结论: 1、不同浓度GM1均具有诱导BMSCs向神经细胞分化的作用，诱导6h后BMSCs向神经细胞分化的分化率最高。 2、中、高浓度GM1诱导BMSCs分化为神经元样细胞的百分率较高，诱导后的神经元样细胞生长状态较好。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、英文缩略语(Abbreviation)

声明

前言

第一章 成人BMSCs的分离培养、传代培养及鉴定

1.1实验材料：

1.2实验方法

1.3实验结果

1.4讨论：

第二章成人BMSCs的定向诱导分化和鉴定

2.1实验材料：

2.2实验方法

2.3结果

2.4讨论：

结论

参考文献

附图

综述：骨髓间充质干细胞及其在缺血性脑损伤中的研究进展

个人简历

致谢