类风湿关节炎患者骨髓间充质干细胞增殖能力及向软骨细胞分化能力的研究

摘要

目的： 通过比较类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者与正常人骨髓间充质干细胞(bone marrow—derived mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖能力及向软骨分化的能力，探讨RA患者BMSCs是否存在缺陷或变异，能否用于自体移植，抑或RA本身就是一种干细胞病，与RA的发病相关。 方法： 1．BMSCs的分离、培养及鉴定：实验分为RA患者组与正常对照组，分别采集8例RA患者与8例健康志愿者骨髓各5ml，用密度梯度离心及贴壁法对细胞进行分离、培养、传代，流式细胞术鉴定P3代BMSCs的表面标志。 2．BMSCs的增殖能力测定：MTT法测定P3、P6代BMSCs生长曲线，计算细胞群体倍增时间；流式细胞术测定细胞周期，计算增殖指数；实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction，RT—PCR)测定端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)的表达。 3．BMSCs在体外软骨诱导培养液中向软骨细胞分化：将P3代BMSCs置于含10ng/ml的rhTGF—β1，丙酮酸钠1mmol/L，地塞米松10-7mol/L，牛胰岛素6.25μg/ml，Vc0.5ul/ml，5％胎牛血清软骨细胞诱导培养液中培养，7天、14天时在倒置显微镜下观察细胞生长状况及形态，14天时用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的分泌，免疫组化法检测Ⅱ型胶原的分泌，以L—DMEM完全培养液中培养的正常人BMSCs为阴性对照。 结果： 1．正常对照组BMSCs在P3代时细胞形态均一，长梭形或多角形，呈平行、旋涡状、辐射状排列。经流式细胞仪检测，CD34、CD45阴性，CD44、CD71阳性，证明获得细胞为间充质干细胞。RA患者BMSCs在形态学上与正常对照组无明显差异。 2．BMSCs增殖能力测定： 2.1正常对照组P3代时细胞群体倍增时间为4.73±0.31天，RA组为4.80±0.33天，两组差异无统计学意义，P＞0.05；P6代时正常对照组细胞群体倍增时间为5.74±0.35天，RA组为6.33±0.34天，RA组BMSCs群体倍增时间长于对照组，差异具有统计学意义，P＜0.001。 2.2正常对照组P3代BMSCs增殖指数为17.87±2.05％，RA组为16.86±2.09％，两组差异无统计学意义，P＞0.05；P6代正常对照组BMSCs增殖指数为10.73±1.78％，RA组为6.17±2.17％，RA组增殖指数小于对照组，差异具有统计学意义，P＜0.01。2.3正常对照组P6代MSCs hTERT表达量为10.63±1.49，RA组为3.08±1.01，RA患者hTERT表达水平较正常对照组低，差异具有统计学意义，P＜0.01。 3．正常对照组MSCs在软骨细胞诱导培养液中培养14天后甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化均为阳性，证实BMSCs成功诱导为类软骨细胞。同样RA组亦可诱导为类软骨细胞。 结论： 1．两组人群均可成功分离、培养得到BMSCs，且RA患者与正常对照组细胞形态无明显差异。 2．两组人群P3代BMSCs细胞增殖能力的差异无统计学意义，但在P6代时RA患者BMSCs的增殖滞后于正常组，推断RA患者BMSCs较正常人衰老速度加快；hTERT测定显示RA组BMSCs的hTERT表达量低于正常对照组，说明这种提前老化可能与hTERT的表达过低有关，hTERT表达减少后不能维持端粒长度，细胞寿命缩短，提前进入衰老、凋亡。 3．两组BMSCs均可在体外诱导培养液中向软骨细胞进行分化。 4．由此推测，RA是一种干细胞病，在BMSCs水平就存在缺陷，而将外源性hTERT导入RA患者BMSCs是自体BMSCs移植治疗RA的一条出路。另外，异体BMSCs移植仍然是治疗难治性RA的一个选择。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

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前言

第一部分 RA患者骨髓间充质干细胞增殖能力的研究

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 RA患者BMSCs向软骨细胞分化能力研究

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

小 结

综　述 骨髓间充质干细胞在类风湿关节炎治疗中的研究进展

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