抗β肾上腺素受体细胞外第二环自身抗体导致大鼠多脏器损伤及其相关机制

摘要

研究背景和目的：β肾上腺素受体(β—adrenoceptor，β—AR)是交感神经系统的重要成员，通过介导体内儿茶酚胺类物质的生理效应，在调节心脏活动中发挥着重要作用。β—AR属于G蛋白偶联受体家族，目前已确认的β1、β2和β3AR三个亚型具有相同的结构特征，即含有由7个22～28个疏水性氨基酸残基组成的跨膜区，连接这些跨膜区的亲水性氨基酸片段构成了3个细胞内环和3个细胞外环。在这三种β—AR亚型中，β1AR在心脏的分布密度最高。当该受体受神经、体液因素调节激活时，通过兴奋型G蛋白—腺苷酸环化酶—环磷酸腺苷系统，使心脏产生正性变时、正性变力、正性变传导效应，以适应机体对血液供应的需求。 Ⅰ．抗β1-AR-ECⅡ抗体可导致心肌重构及可能的机制。 第一分题：抗β1-AR-ECⅡ抗体可导致心肌结构重构及可能的机制。 目的： 1．观察抗β1-AR-ECⅡ抗体被动免疫过程中，大鼠心肌形态学及心功能的变化情况； 2．观察被动免疫过程中，细胞内游离钙水平及CaMKⅡδ的表达情况。 方法： (1)分别选取健康成年雄性Wistar大鼠(n=60，体重180～220g)，由山西医科大学实验动物中心提供，用ELISA法筛选血清抗β1AR-ECⅡ抗体阴性的动物进行分组。 (2)肽段合成：抗原肽段由吉尔生化上海有限公司合成，相当于人β1-AR细胞外第二环氨基酸序列的特异性抗原决定簇(197-223位，HWW RAESDEARRCYNDPKCCDFVT NRA)，合成肽段纯度为95％(见表1)。合成的肽段储存于-20℃备用。 (3)通过大鼠尾静脉定期给入抗体建立被动免疫模型，用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测免疫过程中大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗体水平的变化； (4)分别用体视学指标、Masson三色染色及心重体重比的测量来反映被动免疫过程中大鼠心脏结构的变化； (5)经右侧颈总动脉插管进入左心室，监测心率(Heartrates，HR)、左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张压(Left ventricular diastolic pressure，LVDP)和左心室压力变化最大速率(±dp/dtmax)等心功能指标； (6)分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3、8、9活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况； (7)用Fluo-3—AM探针标记，激光共聚焦测定被动免疫末期大鼠单个心室肌细胞内游离钙离子的水平； (8)用Western—blot及免疫组化法检测大鼠心肌组织中CaMKⅡδ蛋白的表达水平。 第二分题：抗β1—AR—ECⅡ抗体导致心电重构及其可能的机制。 目的： 1．观察抗β1—AR—ECⅡ抗体是否具有直接致心律失常的作用； 2．在组织和细胞水平，探讨抗β1—AR—ECⅡ抗体致心律失常的可能机制，以求阐明抗β1—AR—ECⅡ抗体是否可致心电重构及其可能的机制，为临床抗β1—AR—ECⅡ抗体阳性心律失常患者的治疗提供理论依据。 方法： (1)分别选取健康成年雄性Wistar大鼠(n=172)(其中因麻醉死亡5只，不明原因死亡5只)，体重180～220g，由山西医科大学实验动物中心提供，用ELISA法筛选血清抗β1—AR—ECⅡ抗体阴性的动物进行分组。 (2)通过在体心功能及心电测定方法监测给入抗β1—AR—ECⅡ抗体后正常大鼠心功能及心电图的变化情况； (3)通过微电极记录动作电位的方法，观察在组织水平抗β1—AR—ECⅡ抗体对乳头肌动作电位的影响，同时分析动作电位时程(APD)的变化情况； (4)通过建立主动及被动免疫模型，观察抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对大鼠心电活动的影响，同时分析QT间期的变化； (5)通过膜片钳技术及胞内钙荧光测定技术，观察抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对大鼠心肌细胞膜电流及胞内钙的影响。 结论： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致大鼠心肌重构及心功能障碍的发生，这可能与心肌细胞中游离钙离子水平升高导致CaMKⅡδ的表达增加，进而诱导心肌细胞凋亡增加有关。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗体可导致心律失常的发生，其机制可能与细胞膜静息电位减小，Ik1、Ito及ⅠNa—Ca电流的减弱和ⅠCa—L电流的增强导致的胞内钙离子水平升高和动作电位时程延长有关。 Ⅱ．抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致大鼠肝脏损伤。 目的:证实抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在是否会对大鼠肝脏的结构和功能产生影响。 方法: (1)建立主动及被动免疫模型，用ELISA法检测大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗体水平的变化； (2)用HE和Masson三色染色，观察抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对肝脏结构的影响； (3)通过检测反映肝功能的血清学指标，来证实抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对肝功能的影响。 结论：抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致肝脏结构和功能的损伤，因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗体时，应密切关注患者肝功能的变化。 Ⅲ．抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致大鼠肾脏损伤。 目的：观察抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在能否导致大鼠肾脏结构和功能的损伤。 方法： (1)建立主动及被动免疫模型，用ELISA法检测大鼠血清中抗β1—AR—ECⅡ抗体水平的变化； (2)用HE和Masson三色染色，观察抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对肾脏结构的影响； (3)通过检测反映肾功能的血清学指标，来证实抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在对肾功能的影响。 结论：抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在会对肾脏结构及功能产生一定损伤，因此，血清中存在高水平抗β1—AR—ECⅡ抗体的患者应密切关注肾功能的变化情况。 本研究中存在一些不足之处：关于抗β1—AR—ECⅡ抗体致心肌细胞凋亡的信号通路研究中，只观察到：在主动及被动免疫过程中，随着免疫时间的延长心肌CaMKⅡδ的表达逐渐增加，但尚缺乏抗β1—AR—ECⅡ抗体直接作用能否导致CaMKⅡδ的表达增加，以及抑制CaMKⅡδ后，抗β1—AR—ECⅡ抗体诱导的心肌细胞凋亡是否会减少等一系列问题，对于这些问题的解释，将通过进一步的成鼠心肌细胞培养来证实。 本研究首次发现抗β1—AR—ECⅡ抗体可致肝肾损伤，但其如何导致肝肾损伤及其相关机制还有待进一步深入。 结论： 1．抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致大鼠心肌重构及心功能障碍的发生，这可能与心肌细胞中游离钙离子水平升高导致CaMKⅡδ的表达增加，进而诱导心肌细胞凋亡增加有关。 2．抗β1—AR—ECⅡ抗体可导致心律失常的发生，其机制可能与细胞膜静息电位减小，Ik1、Ito及INa—Ca电流的减弱和ICa—L电流的增强导致的胞内钙离子水平升高和动作电位时程延长有关。 3．抗β1—AR—ECⅡ抗体长期存在可导致一定程度的肝肾损伤。环中产生的抗β1-AR-ECⅡ抗体是否也能通过与肝脏和肾脏细胞表面的β1-AR结合，从而产生一定的作用呢? 前期在用β1—AR—ECⅡ肽段进行18个月的主动免疫大鼠过程中观察到：有相当数量的大鼠出现了腹水和肝缘变钝的现象，引起本研究的极大关注。对于腹水的临床检验结果表明：腹水中细胞数及蛋白水平偏高，葡萄糖水平偏低，同时腹水可以自然凝固，基于以上性质确定该腹水为渗出液，而非漏出液；同时结合大鼠的心功能状况判定，腹水不是由于心衰而导致的，那么形成腹水的原因是什么，尚不得而知；但结合肝缘变钝这一大体现象，考虑肝脏病变可能是形成腹水的原因之一，但不能排除肾脏在免疫过程中是否也受到损伤。因此在本课题中，也将对这一问题进行初步探索。 综上所述，本课题拟进行以下三方面的研究： ①采用被动免疫模型，探讨抗β1-AR-ECⅡ抗体长期存在是否会导致心肌组织CaMKⅡδ表达的改变，同时观察心肌细胞内钙离子水平的变化；观察抗β1-AR-ECⅡ抗体致心律失常的直接作用、长期作用及其可能的机制； ②建立主动及被动免疫模型，观察抗β1-AR-ECⅡ抗体长期存在是否会导致肝脏损伤的发生； ③建立主动及被动免疫模型，观察抗β1-AR-ECⅡ抗体长期存在是否会导致肾脏损伤的发生。

目录

文摘

英文文摘

声明

SECTIONⅠPART ONE:Long-term Existence of Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenoceptor Could Induce the Increase of Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase Ⅱδin Rat Cardiomyocytes

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION ⅠPART TWO: The Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenoceptor Could Induce Arrhythmia in vivo and in vitro

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION I PARTTHREE:Arrhythmia Could be Induced by the Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenoceptor and its Possible Mechanisms

Abstract

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION Ⅱ Long-term Existence of the Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenoceptor Could Reslut in Liver Injury of Rats

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

SECTION Ⅲ.Long-term Existence of the Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of β1-Adrenoceptor Could Result in Kidney Injury of Rats

Abstract

Introduction

Materials and Methods

Results

Discussion

References

Tables and Figures1

Tables and Figures2

综述 抗心脏G蛋白偶联受体自身抗体与心律失常相关性研究进展

译述 关于β肾上腺素受体亚型信号通路的新观点及治疗意义

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