疑难降解检材DNA检验方法研究

摘要

目的：本论文以陈旧骨骼、牙齿及福尔马林固定石蜡包埋组织中残留的少量降解的核酸分子作为研究对象，利用多种技术方法，比较并建立适合降解检材的提取技术方法。并将建立的方法应用于其他案件中常见微量降解的检材；对骨骼、牙齿、福尔马林固定石蜡包埋组织及其他疑难降解检材中没有得到完整STR分型的，应用MiniFilerTM试剂盒进行检验，并评估MiniFilerTM试剂盒在疑难降解检材STR分型中的法医学应用价值。 方法：选取10例已知检验结果的骨骼和牙齿样本，分别用不同脱钙、不同裂解液、不同纯化的方法进行实验并比较；在此基础上改进并建立骨骼提取的方法；并应用建立的方法对24例案件中骨胳样本进行检验。 选取10例医院病理科收集的福尔马林固定石蜡包埋组织，经不同的脱蜡温度和脱蜡时间预处理后提取石蜡包埋人体组织中的DNA进行复合扩增检验，比较不同预处理方法对DNA提取效果的影响；选取经上述预处理后效果最优的一组分别采用有机法和Chelex-100法进行提取，比较两种方法的提取效果；将10例石蜡包埋组织得到的分型结果与相应的血样DNA进行比对，观察癌组织基因突变对PCR反应及结果分析的影响。 对13例其他疑难降解检材，包括现场血迹、毛发、口香糖、烟蒂等采用MiniFilerTM与IdentiFilerTM试剂盒进行检验，并对两种试剂盒的检测灵敏度进行比较。 结果：用于比较研究的10例骨骼和牙齿样本经过预脱钙后的检验结果明显优于未脱钙的结果；OEB与异硫腈胍裂解液(GuSCN裂解液)消化的能力无显著性差异；使用QIA quick Spin Column纯化柱的检验较Microncon100有明显优势。建立了OEB混合液裂解联合QIA quick Spin Column纯化骨骼样本的方法。案件应用中的24例骨骼和牙齿样本，其中23例的检验均得到12个以上STR基因座的结果，仍有一例无STR分型结果。10例福尔马林固定石蜡包埋组织，室温中时间分别为2、12小时2次脱蜡与37℃一次脱蜡10min组得到的分型图谱没有明显差异，而37℃分2次脱蜡，时间分别为2、12小时组得到的分型图谱峰高值均好于前两组，脱蜡均较彻底。10例样本经有机法提取QIA quick纯化柱纯化组，有9例均得到完整STR分型结果，仅有1例得到部分基因座的分型结果：而经Chelex-100法提取组无1例得到STR分型结果。癌组织的基因突变会使STR分型结果发生改变，本文10例癌组织石蜡切片发现存在嵌合、等位基因丢失、峰高不均衡等现象。采用MiniFilerTM与IdentiFilerTM试剂盒对13例其他疑难降解检材检验的结果显示：13例其他疑难降解检材采用IdentiFilerTM试剂盒的检验，在未定量的情况下经过1μl、2μl、4μl梯度扩增，13例无1例获得完整分型，片段长度在200-370bp范围内的基因座均有不同程度的等位基因缺失；而采用MiniFilerTM试剂盒补充检验均获得完整分型。采用对照样本DNA9947对MiniFilerTM试剂盒和IdentiFilerTM试剂盒灵敏度检测发现，MiniFilerTM试剂盒可以达到0.01ng，而IdentiFilerTM试剂盒可以达到0.08ng。 结论：本文建立的OEB混合液裂解联合QIA quick Spin Column纯化骨骼样本的方法稳定高效，可用于陈旧骨骼及牙齿样本的DNA检验：在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA的提取过程中，适当的增加温度、延长脱蜡时间、有机法提取联合QIA quick纯化柱纯化的方法均可以提高DNA的检验成功率；在其他疑难降解检材的研究中，MiniFilerTM试剂盒作为IdentiFilerTM试剂盒检验之后的补充手段可以提高降解检材的检验成功率，适合应用于法庭科学实际检案中降解检材的检验鉴定。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分骨骼及牙齿DNA提取方法的比较与改进

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分福尔马林固定石蜡包埋组织STR检验的探讨

1材料与方法

2结果

3讨论

4案例应用

第三部分其他疑难降解检材DNA检验的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4案例应用

参考文献

附录

综述 疑难降解检材检验方法的研究进展及其在法医检验过程中的应用

个人简历

致谢