吲哚胺2，3-双加氧酶对效应CD8+T细胞溶胞作用的免疫抑制作用

摘要

目的：吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase， IDO）通过耗竭局部的色氨酸（L-tryptophan）或/和色氨酸的代谢产物抑制了T淋巴细胞的增殖，诱导了T淋巴细胞的凋亡，然而在T淋巴细胞凋亡/死亡之前是否还发生了功能上的改变，目前还缺乏这方面的研究。本研究就是为了探讨IDO对效应CD8+T细胞溶胞作用的免疫抑制作用，并初步探讨其机制，为IDO在T淋巴细胞免疫应答中的作用提供新的理论依据。
　　 方法：通过lipofectamineTM2000转染试剂将pcDNA3.1-IDO 转入肝癌细胞株SMMC-7721细胞，设置pcDNA3.1-IDO 转染组（I组）、pcDNA3.1-IDO 转染并加入1-甲基-D-色氨酸（1-D-MT）组（I+1-D-MT组）、pcDNA3.1转染组（P组）和SMMC-7721细胞与CD8+T细胞共培养组（7721组），转染48h后应用RT-PCR和Western blot方法检测IDO基因在SMMC-7721细胞中的表达情况。从健康人外周血中分离出CD8+T细胞后与瞬时转染pcDNA3.1-IDO的SMMC-7721细胞（I组）、单纯转入pcDNA3.1的SMMC-7721细胞（P组）、SMMC-7721细胞（7721组）和用1-D-MT干预的I组（I+1-D-MT组）混合培养4～6h后，用LDH检测试剂盒检测各组中效应CD8+T细胞对SMMC-7721细胞的溶胞作用；混合培养48h后用RT-PCR和Western blot 检测各组中效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B的表达情况。
　　 结果：1、质粒鉴定 质粒经测序后与基因库对比，结果与基因库完全一致。2、用RT-PCR与Western Blot 检测瞬时转染的SMMC-7721细胞和与CD8+T细胞共培养的SMMC-7721细胞的IDO表达情况可知：I组表达IDO mRNA（0.95±0.021）及IDO蛋白（1.04±0.078）且高于I+1-D-MT组（0.58±0.032，0.87±0.051），两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。P组和7721组则不表达IDO mRNA及IDO蛋白。3、用RT-PCR 检测各组中效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B mRNA的表达情况可知：各组的效应CD8+T细胞均表达颗粒蛋白酶B mRNA，且不受IDO的影响（I组、P组和7721组分别为1.38±0.017、1.21±0.021、1.32±0.027），前者与后两者比较差异无统计学意义（P>0.05）；加入1-D-MT（浓度为2.5 mmol/l）后也没有逆转的现象（1.39±0.016），与I组比较差异无统计学意义（P>0.05）。4、用Western blot 检测各组中效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B蛋白的表达情况可知：I组(0.52±0.017)效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B蛋白的表达低于P组和7721组（分别为1.02±0.023、1.15±0.055），前者与后两者比较差异有统计学意义（P<0.05）；I+1-D-MT组（浓度为2.5 mmol/l）效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B蛋白的表达(1.01±0.025)高于I组(0.52±0.017)，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。5、用LDH检测试剂盒检测各组中效应CD8+T细胞对SMMC-7721细胞的溶胞作用可知：I组(15.32±4.06％)效应CD8+T细胞的溶胞作用低于P组和7721组（分别为60.37±1.53％、60.88±1.49％），前者与后两者比较差异有统计学意义（P<0.05）；I+1-D-MT组（浓度为2.5mmol/l）效应CD8+T细胞的溶胞作用(60.34±1.23％)高于I组(15.32±4.06％)，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。
　　 结论：瞬时转染IDO基因的SMMC-7721细胞表达IDO mRNA及IDO蛋白，且1-D-MT抑制了IDO mRNA及IDO蛋白的表达；SMMC-7721细胞表达的IDO通过降低效应CD8+T细胞的颗粒蛋白酶B蛋白的表达而非mRNA的表达，抑制了效应CD8+T细胞对SMMC-7721细胞的溶胞作用，而IDO的这种作用可以被1-D-MT所逆转。

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