SPIO纳米颗粒标记BMSCs移植治疗兔脊髓损伤的MR活体示踪

摘要

研究背景：干细胞是指有多向分化潜能和自我更新能力的细胞，这种细胞存在于成年个体的许多组织和胚胎中。研究己证明哺乳动物脊髓内的干细胞在病理或生理状态下都具有很强的迁移与分化能力，实行干细胞替代治疗有望重建脊髓损伤的组织功能，是一种很有前途的临床治疗策略。近年来，研究证实，骨髓间充质干细胞(bone mesenchymAlstem cells,BMSCs)具有向神经元细胞分化的潜能，并具有来源充足、获取方便、可进行自体移植的特点，避免了使用干细胞所带来的免疫排斥反应和伦理学争议等优势，因此目前已成为干细胞移植替代治疗最理想的种子细胞来源之一。目前，应用BMSCs 移植治疗脊髓损伤已成为一个研究热点。
　　 为明确BMSCs 移植后对神经功能或行为是否有改善，传统大多采用处死动物后进行组 织切片加以验证两者的相关性。这类方法都具有侵袭性，不利于对移植后BMSCs在活体内的迁移的动态示踪，并且这些方法也不能适用于临床应用研究。基于以上原因，如果能在合适的示踪剂帮助下，采用无创伤性影像学技术来活体识别、示踪移植后BMSCs的存活、迁移及与宿主神经组织整合情况并科学评价疗效，将大大提高BMSCs 移植治疗的学术价值。最新研究显示，磁共振（Magnetic resonance，MR）造影剂超顺磁性氧化铁(Superparamagnetic Iron Oxide，SPIO)纳米颗粒在体外可用于多种细胞的标记，从而为我们提供了利用MR 活体、动态示踪干细胞在体内迁移的可能。菲立磁是经过美国食品及药物管理局批准临床上应用的造影剂，可借助转染试剂多聚赖氨酸的帮助用于多种动物干细胞的标记。
　　 本课题以兔骨髓来源的BMSCs为研究对象，对其进行体外分离和扩增，同时观察SPIO标记后BMSCs 生物学特性的改变，并利用MR对SPIO 标记BMSCs 自体移植脊髓损伤模型进行活体示踪。
　　 第一部分
　　 目的：探索一种分离、培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞并适宜其在体外快速增殖的方法。方法：1.采用贴壁筛选法和密度梯度离心法分离、培养、纯化骨髓MSCs，研究MSCs在体外生长的基本特征，用流式细胞术检测MSCs常见的表面标记物，以证实培养细胞是否具有间充质干细胞的初步特征。2.MSCs的诱导分化与检测:分别用成骨、成脂肪的常用诱导培养基诱导MSCs进行分化，通过碱性磷酸酶(ALP)染色和Von Kossa法进行矿化结节染色，以及油红O染色，从而证明MSCs的成骨和成脂肪潜能的存在。结果：1.MSCs原代细胞呈短梭形形态，体外能长期培养与扩增；生长曲线呈S型，流式检测细胞表面标记物提示MSCs的CD29和CD44表达呈阳性,CD34和CD45表达呈阴性，这符合间充质干细胞的特征。2. MSCs在体外成骨诱导有明显的矿化结节沉淀，经Von Kossa法染色后结果呈阳性；钙钴法进行ALP染色，ALP水平明显增高，这结果均提示MSCs具有向成骨分化的潜能。MSCs在体外成脂肪诱导后进行油红O染色显示阳性，提示MSCs具有向脂肪细胞分化的特点。结论：应用本实验方法，可以分离、纯化培养兔MSCs，且操作简便，效率高，经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代，可用于进一步的研究。
　　
　　 第二部分
　　 目的：探讨以不同SPIO浓度标记兔BMSCs的标记率，和对细胞活力、细胞增殖能力的影响，以及体外MR 成像显示SPIO 标记干细胞的可行性。方法：配制不同浓度含SPIO的培养基(铁终浓度分别为25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)，加入BMSCs 孵育标记。标记后1天、3天、1周、2周、3周、4周行普鲁士蓝染色、台盼蓝拒染实验、MTT 检测，以及标记细胞的体外MR 成像。确定SPIO的最佳标记时间和标记浓度。结果：各标记浓度组均有较高的标记率，细胞胞质内可见蓝染的铁颗粒，且随标记浓度增加蓝染颗粒增多、染色加深；对照组染色呈阴性。台盼蓝拒染实验（细胞活力检测）显示标记时间为1天和3天时，剂量0μg/ml组与25μg/ml组，0μg/ml组与50μg/ml组，25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒染率（细胞活力）没有差别（P>0.05)。MTT 检测显示SPIO浓度为25μg/ml、50μg/ml时对细胞的增殖无影响。体外细胞的MR 成像显示：各标记浓度组T1WI上信号无差异，T2WI上各标记浓度组均引起信号的减低，浓度越高引起的信号减低越明显，50、75、100、150μg/ml组间信号减低程度差异无统计学意义。结论：SPIO 可有效标记BMSCs，标记1～3天和25～50μg/ml是安全、有效的标记时间和标记浓度；为MR 活体示踪移植BMSCs 奠定了基础。
　　
　　 第三部分
　　 目的：探讨SPIO 标记后的BMSCs 被定向诱导分化为神经元样细胞的可行性，以及诱导分化而来的神经元样细胞的存活情况和细胞功能状态。方法：以25μg/ml的SPIO浓度标记兔骨髓间充质干细胞，用β-巯基乙醇(BME)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其进行定向诱导，观察MSCs 诱导分化成神经元样细胞的形态学改变过程。应用免疫细胞化学染色方法鉴定诱导而来细胞的神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经微管相关蛋-2(MAP-2)的表达。采用普鲁士蓝染色法鉴定诱导分化而来的神经元样细胞胞浆内的纳米铁颗粒是否还存在。使用Calcein-AM/PI 双染细胞，检测细胞存活率。以Flu0-3/AM作为钙离子荧光探针，使用激光共聚焦显微镜动态测定神经元样细胞内钙离子浓度变化，观察细胞功能状态。未标记组细胞做对照组。结果：BMSCs在正式诱导后6h细胞胞体开始向胞核收缩，呈圆形或类圆形；诱导24h后大多细胞胞体呈圆形，部分伸出的2、3级突起相互交织成网状。细胞的外形具有神经元样细胞的特征。免疫细胞化学染色鉴定神经元样细胞的NSE和MAP-2 染色的表达呈阳性。经普鲁士蓝染色发现神经元样细胞胞浆内仍然可见到蓝染铁颗粒的存在。标记组与对照组诱导而来的神经元样细胞，通过Calcein-AM/PI 染色检测，其存活率均较高，分别为93.5％和94.1％，两者无统计学差异(P>0.05)。标记组与对照组诱导分化来的神经元样细胞内的钙浓度变化无差异（P>0.05)，说明细胞均保持着良好的状态。结论：SPIO在25μg/ml的标记浓度下，BMSCs 可被诱导分化成神经元样细胞；其细胞浆内仍保留着纳米铁颗粒；神经元样细胞的存活和细胞功能状态均良好。
　　
　　 第四部分
　　 目的：制备兔脊髓损伤模型，研究其病理学、行为学和影像学改变，为下一步的干细胞移植治疗提供可靠的动物模型。方法：咬除兔L2的棘突及相应椎板，用自行研制的实验装置，制备脊髓损伤模型。并将分离的肌肉缝合封闭椎管缺损，缝合皮肤，将经过相同措施处理但未损伤脊髓的兔作为对照组。对两组兔在制模成功后进行Tarlov 评分、病理学和MRI 检查。结果果：根据Tarlov 评分标准兔脊髓损伤模型成功建立，脊髓损伤区出现明显的病理和影像学的改变。结论：利用本实验方法可成成功制备兔脊髓损伤模型，为下一步研究干细胞移植治疗脊髓损伤提供了可靠的动物模型。
　　
　　 第五部分
　　 目的：通过蛛网膜下腔置管，将SPIO 标记后的骨髓间充质干细胞移植入兔脊髓损伤模型，观察脊髓损伤的运动功能的恢复和MR 活体示踪移植细胞的可行性。方法：制作兔SCI 模型，并在蛛网膜下腔置管以备移植。将实验用大白兔随机分为3组：A组为移植SPIO 标记细胞；B组为移植未标记细胞；C组不移植细胞只注射PBS 液做对照组。在细胞移植后3、7、14、21、28、35天，观察不同组SCI 模型的运动功能BBB 评分。在细胞移植后3、7、14、21天，对移植细胞进行MR 活体示踪，并做病理学检测进行对照。结果：A、B两组的移植模型，在细胞移植14天后运动功能BBB 评分高于C组，其差异有统计学意义；而A、B两组间运动功能BBB 评分差异无统计学差异。SPIO 标记的MSCs 移植入脊髓损伤模型后7天，行磁共振扫描，T2WI上脊髓损伤区域出现点状低信号影；14天后T2WI上脊髓损伤区域的点状低信号影增多，21天后T2WI上脊髓损伤区域的点状低信号影减少。脊髓损伤区域组织切片行普鲁士蓝染色，发现局部组织上出现大量含蓝色铁颗粒的细胞，其细胞变化规律与MRI 示踪结果一致。结论：蛛网膜下腔移植的SPIO 标记MSCs 可定向迁移到脊髓损伤区域，对脊髓损伤的运动功能恢复有帮助；利用MR 可对移植细胞进行活体示踪。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词对照表

声明

前言

第一部分兔骨髓间充质干细胞的分离培养、传代及鉴定

第二部分SPIO 标记MSCs 生物学特性检测和体外MR 成像研究

第三部分SPIO标记骨髓MSCs体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

第四部分兔脊髓损伤模型的制备

第五部分蛛网膜下腔移植SPIO 标记的MSCs 在兔脊髓损伤模型的MR 活体示踪研究

结论

综述一 干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

综述二 SPIO标记骨髓间充质干细胞与磁共振示踪成像研究进展

作者简历

致谢