周围神经损伤修复后早期骨骼肌细胞凋亡的初步研究

摘要

目的：探讨神经修复后早期大鼠骨骼肌萎缩中骨骼肌细胞凋亡情况。
　　 方法：选择健康雄性SD大鼠54只，体重200±10g，随机分为3组，失神经对照组（A组，18只），神经吻合组（B组，18只），正常对照组（C组，18只）。应用10％水合氯醛（0.3ml/100g）对大鼠行腹腔麻醉，麻妥后，A组，于左侧股二头肌前缘肌间隙进入暴露分离坐骨神经，以坐骨神经分为腓总神经和胫神经处以近1.5cm为中点切除上下各0.5cm之坐骨神经，远近两端自然回缩；B组，于相同位置在未经任何处理情况下应用快刀片将坐骨神经截断，随即在手术显微镜下应用10-0医用尼龙线以外膜血管为参照将两断端外膜吻合，神经处理完毕后，应用生理盐水冲洗手术野，逐层闭合，术后未应用抗生素，未对患肢进行固定；C组不做任何处理。分别在2d，14d，28d在A，B，C三组中随机取出6只大鼠，测量体重，应用颈椎脱臼法将其处死，将大鼠左侧腓肠肌自肌肉起止点完整取出，测定腓肠肌肌湿重（GAS）后将其分成两份， 一部分（大于200g）加入冰细胞裂解液100μl， 应用超声波匀浆仪低温下（4℃）组织裂解。一部分置于4％中性多聚甲醛溶液中固定12小时，随后在不同浓度蔗糖溶液中上行脱水直至沉底。随后，在-20℃条件下，制作腓肠肌横断面冰冻切片，切片厚度15μm，对切片进行封闭（室温下浸入3％H2O2甲醇溶液，10分钟）与通透（冰上浸0.1％TritonX-100柠檬酸钠溶液，2分钟）。随后将冰冻切片置于荧光素（FITC）标记的脱氧核苷酸末端转移酶（TdT酶）混合液中，在37℃避光湿润条件下行60分钟标记反应。同时制备阳性对照样本——切片在脱氧核糖核酸酶I（DNase I）反应液中37℃处理10～30分钟；阴性对照样本——切片在不含有TdT酶的反应液中进行处理。标记反应完毕后，选择4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染， 加入500μL的DAPI工作液（DAPI浓度为1-2μg/mL的甲醛溶液），37℃孵育15分钟，甲醇漂洗后防荧光淬灭封片剂封片。应用激光共聚焦显微镜对切片进行观察，计数凋亡细胞核。将制备好的组织匀浆液转移到1.5mL预冷离心管， 10000转/分，4℃离心5分钟；保留上清液于冰上待用。应用Braford法测定蛋白浓度，当蛋白含量达标后（＞2μg/μl）， 吸取50μL上清液加入50μL反应缓冲液和5μL Caspase-3底物或Caspase-8底物于370C避光孵育4小时，应用荧光分光光度计在波长405 nm 处测吸光度值（OD），以不加底物的样本作为阴性对照。通过计算OD反应组/OD阴性对照来确定各组Caspase-3或Caspase-8活化程度。数据以均数±标准差（±s）表示，用SAS统计学软件处理。
　　 结果:在SD大鼠神经损伤（离断伤）修复（神经缝合）后早期骨骼肌相对正常神经支配骨骼肌，骨骼肌细胞凋亡现象有所增加，凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-8 活性较正常神经支配骨骼肌亦有所上升，但凋亡细胞核数量，Caspase-3和Caspase-8 活性均弱于完全失神经骨骼肌。
　　 结论：骨骼肌细胞凋亡是SD大鼠周围神经损伤修复后早期骨骼肌萎缩的机制之一， 死亡受体信号通路参与到了神经修复后早期骨骼肌凋亡过程中。

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材料与方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

综 述1 失神经骨骼肌萎缩与骨骼肌细胞凋亡

综 述2 经鹰嘴肘关节骨折脱位的诊断与治疗

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