体外不同培养时间影响CD3-CD56+NK细胞数量及活性变化的研究

摘要

背景
　　 19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患者一个新的希望。自然杀伤(natural killer.NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。但NK细胞在外周血中的数量有限且在体外难以培养，所以NK细胞的体外培养就成为一项影响NK细胞过继免疫治疗临床疗效的关键步骤，影响NK细胞的培养因素众多，而培养时间是一个基本的但又不可避免的影响因素。近年来多项研究提示异体半相合NK细胞在造血干细胞移植和过继性细胞免疫治疗方面均显示出对人类血液系统肿瘤的积极治疗作用，但自体NK细胞过继免疫治疗的临床效果却不能令人满意。这就促使我们对异体（通常是健康人群）NK细胞培养后的细胞数量（细胞存活率、NK细胞的百分率和T细胞的百分率）及活性（NK细胞对K562细胞和RPIM8226细胞的杀伤活性）变化与培养时间的关系进行充分的了解；以及健康人群与AML患者NK细胞培养后的细胞数量（细胞存活率、NK细胞的百分率和T细胞的百分率）及活性（NK细胞对K562细胞和RPIM8226细胞的杀伤活性）的差异进行充分的了解。
　　 目的
　　 探讨健康人群NK细胞在培养过程中随培养时间的变化，细胞数量、细胞存活率、NK细胞的百分率、T细胞的百分率及NK细胞对K562细胞和RPIM8226细胞的杀伤活性的变化，确定健康人群NK细胞的最佳培养时间；同时与AML患者NK细胞培养过程中细胞数量、细胞存活率、NK细胞的百分率和T细胞的百分率及对K562细胞和RPIM8226细胞的杀伤活性的变化的进行比较，明确两者之间的差异。为异体NK细胞免疫治疗更好的应用于临床做准备。
　　 方法
　　 1.采取10例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科10例AML患者外周血15ml，运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞，分别放于含有SCGM培养基的培养孔中培养，前Sd加入0.5ulCD3McAb，在培养的第Sd，倒掉含有CD3McAb的培养液，加入含有rhIL-2的SCGM培养基。隔日补充一次培养液，直至第25d。
　　 2.运用细胞计数仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的细胞数量及细胞存活率。
　　 3.运用流式细胞仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d细胞中的NK细胞百分率和T细胞百分率。
　　 4.采用比色法检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d分选出的NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性。
　　 结论
　　 1.总细胞和NK细胞的数量、NK细胞的百分率、NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性与培养时间呈正相关；T细胞的百分率与培养时间程负相关。也就是说，NK细胞的数量及活性在一定培养时间内，随着培养时间的延长而增加。
　　 2.健康志愿者和AML患者相比，总细胞数在培养的第20d开始出现显著性差异；NK细胞的百分率在培养的第10d开始出现显著性差异；NK细胞对RPMI8226的杀伤活性在培养的第15d开始出现显著性差异；细胞存活率、T细胞的百分率、NK细胞对K562细胞的杀伤活性在培养期间没有出现显著性差异。健康志愿者的NK细胞培养之后优于AML患者的NK细胞。
　　 3.健康志愿者的NK细胞在培养的第20d，总细胞和NK细胞的数量、NK细胞的百分率、NK细胞对K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性均达到最佳状态，故健康志愿者即健康人群NK细胞的最佳培养时间间期是20d。