脱细胞晶状体前囊膜为载体培养角膜缘干细胞的实验研究

摘要

目的：通过将增殖能力较强的青年期兔角膜缘干细胞(limbalstemcell,LSCs)[1]原代培养，扩增后探索适宜的种植细胞密度。将其种植于同种异体晶状体前囊膜上，探讨晶状体前囊膜为角膜缘干细胞培养载体潜在价值，为组织工程化角膜上皮载体选择提供新的载体材料。
　　方法：（1）用酶消化法将增殖能力较强的青年兔角膜缘组织制备成细胞悬液培养，原代培养后将传代细胞（2代），用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液将其制备成1.0×106、1.0×105、1.0×104个细胞/ml的细胞悬液。将其接种于48孔培养板，观察在基础培养条件一定的情况下传代（2代）培养角膜缘干细胞的生长情况，48h检测其细胞贴壁率并记录细胞融合时间；CCK-8法检测增殖活性。（2）以适宜细胞密度将其种植于同种异体兔晶状体前囊膜上，对照组无为无载体培养，DMEM:F12为基础培养液，观察在其上的生长情况，免疫荧光法检测角膜缘细胞的△Np63、角蛋白K3表达，运用SPSS18.0统计软件对所获数据进行统计分析。
　　结果：（1）在基础培养条件一定的情况下，以1.0×104个细胞/ml接种48h换液，悬浮细胞较多，可见少数细胞贴壁生长，细胞贴壁率低和融合成单层时间长，与其他两组比较差异有统计学意义（P<0.001）。以1.0×106和1.0×105个细胞/ml接种，48h贴壁细胞明显增多。贴壁率分别为86.84±7.04和74.52±6.16；细胞融合成单层时间分别是6.02±0.52和7.06±0.46;两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。CCK-8法生长曲线显示，以1.0×105个细胞/ml细胞密度接种，细胞有较强的增殖活性，细胞密度过高过低在有限的培养条件下都会对细胞增殖产生影响。（2）同种异体晶状体前囊膜为载体，角膜缘干细胞可贴壁生长，细胞形态呈圆形、椭圆形和多边形，细胞间连接紧密。约7天左右可形成细胞植片。免疫荧光染色△Np63大部分细胞呈阳性，角蛋白K3少量细胞表达；随着培养时间的延长△Np63表达量下降，角蛋白K3表达量上升，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：适宜的种植细胞密度有利于角膜缘干细胞生长特性的维持；角膜缘干细胞接种于晶状体前囊膜上，细胞可以贴壁生长，可以形成类似于角膜上皮的结构；同种异体种植，角膜缘干细胞可在其上生长，说明晶状体前囊膜是一种极为冷淡的载体材料。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

前 言

材料和方法

一、材料

二、实验方法

结 果

一、种植密度对角膜缘干细胞传代培养的影响

二、晶状体前囊膜为载体培养角膜缘干细胞的形态观察及鉴定

讨 论

一、酶消化法是分离纯化角膜缘干细胞一种有效的方法

二、角膜缘干细胞培养基及血清浓度的选择

三、种植细胞密度对传代角膜缘干细胞培养的影响

四、脱细胞晶状体前囊膜为角膜缘干细胞培养载体的可行性

五、晶状体前囊膜为载体培养角膜缘干细胞的鉴定

结 论

附 图

参考文献

综 述

致谢

个人简介