亚慢性染毒B[a]P对大鼠海马神经细胞凋亡及PKA/ERK/CREB信号通路的影响

摘要

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是多环芳烃类环境污染物的主要成分，脂溶性较好，能穿越血脑屏障，还能通过嗅球进入到中枢神经系统，可在小脑等部位蓄积。职业接触焦炉逸散物的工人植物神经功能紊乱、短期记忆能力受到损害。国内外学者对B[a]P的神经毒性展开了大量研究，结果显示，B[a]P导致人和动物短期记忆能力和空间记忆能力下降，其作用与血浆B[a]P浓度和脑内B[a]P代谢物浓度显著相关。有研究认为B[a]P引起神经细胞凋亡可能与其诱发的学习记忆能力下降有关，但具体机制尚不清楚，本研究旨在通过进一步分析B[a]P诱发神经细胞凋亡的机制和B[a]P对长时程增强(Long-term potentiation，LTP信号通路的影响两方面，进一步探讨B[a]P损害大鼠空间学习记忆能力的分子机制。
　　 目的：通过B[a]P亚慢性染毒大鼠模型，观察大鼠海马细胞凋亡相关基因、蛋白水平及其活性的变化和海马组织PKA/ERK/CREB信号通路相关基因和蛋白表达及磷酸化的改变，探讨B[a]P诱发神经细胞凋亡的机制和对PKA/ERK/CREB信号通路的影响，进一步探索B[a]P损害大鼠空间学习记忆能力的分子机制。
　　 方法：选择健康雄性SD大鼠50只，根据染毒前空间学习记忆能力的测定结果，随机将大鼠分为空白对照、溶剂对照、1.0、2.5和6.25mg/Kg B[a]P染毒组，腹腔内注射染毒90天，Morris水迷宫测定大鼠空间学习记忆能力，分离大鼠海马组织，流式细胞术测定海马神经细胞凋亡情况;荧光定量PCR法测定基因mRNA表达水平;Western Blot法测定蛋白表达水平及磷酸化水平;分光光度法测定Caspase3，Caspase6，Caspase9蛋白活性。
　　 结果：
　　 1、各组大鼠之间第1-5天的游泳速度和平均游泳速度无显著性差异(P＞0.05);染毒组大鼠第1-5天的逃避潜伏期均高于空白对照和溶剂对照组，其中，第1天、第2天和第5天6.25 mg/Kg B[a]P组大鼠逃避潜伏期显著高于空白对照组、溶剂对照组和1.0mg/Kg B[a]P组(P＜0.05)，第1天1.0和2.5mg/KgB[a]P组、第3天2.5mg/Kg B[a]P组、第5天2.5和6.25 mg/Kg B[a]P组逃避潜伏期显著高于空白对照组(P＜0.05)。第2天、4天2.5mg/Kg B[a]P组和第3天6.25mg/KgB[a]P组天逃避潜伏期显著高于空白对照组和1.0mg/Kg B[a]P组(P＜0.05）。2.5和6.25mg/Kg B[a]P组大鼠平均逃避潜伏期均高于空白对照组和溶剂对照组(P＜0.05）。2.5和6.25 mg/Kg B[a]P组穿越平台次数显著低于空白对照组、溶剂对照组和1.0mg/Kg B[a]P组(P＜0.05);6.25mg/Kg B[a]P组平台象限滞留时间显著低于空白对照组、溶剂对照组、1.0和2.5mg/Kg B[a]P组(P＜0.05);6.25mg/KgB[a]P组平台象限滞留百分比显著低于空白对照组、溶剂对照组和1.0mg/KgB[a]P组(P＜0.05）。
　　 2.早期凋亡率呈随染毒剂量增加而增高的趋势（P趋势＜0.05），其中1.0、2.5和6.25mg/Kg B[a]P组早期凋亡率显著高于空白对照和溶剂对照组（P＜0.05）。与空白对照、溶剂对照、1.0和2.5mg/Kg B[a]P组比较，6.25mg/Kg B[a]P组BAX表达水平显著升高（P＜0.05），BCL-2表达水平和BCL-2/BAX比值显著下降（P＜0.05）;2.5和6.25mg/Kg B[a]P组Caspase3、Caspase6表达水平显著高于空白对照、溶剂对照和1.0mg/Kg B[a]P组(P＜0.05)，Caspase9表达水平无明显改变（P＞0.05）;2.5和6.25mg/Kg B[a]P组Caspase3、Caspase6和Caspase9活性显著高于空白对照和溶剂对照组（P＜0.05）;大鼠海马组织Caspase3、Caspase6和Caspase9活性与细胞早期凋亡率呈正相关关系(r=0.793，p=0.019; r=0.886，p=0.006;r=0.773，p=0.025)。各组BAX、BCL-2、Caspase3、Caspase6和Caspase9基因mRNA表达水平均无显著性差异（P＞0.05）。
　　 3.染毒后，2.5和6.25mg/kg B[a]P组PKA mRNA表达水平显著低于空白对照和溶剂对照组;1.0、2.5和6.25mg/kg B[a]P组ERK1，1.0 mg/kg组ERK2 mRNA表达水平显著低于空白对照组;6.25mg/kg B[a]P组CREB mRNA表达水平显著低于其余四组;各染毒组C-FOS和C-JUN mRNA表达水平显著高于空白对照组;以上差异均有统计学意义(P＜0.05）。2.5和6.25mg/kg B[a]P组PKA蛋白表达水平显著低于空白和溶剂对照组（P＜0.05）。ERK1/2、CREB、C-FOS、C-JUN、BDNF蛋白表达水平均无显著变化（P＞0.05）。2.5和6.25mg/kg B[a]P组PKA、ERK1/2、CREB蛋白磷酸化水平均显著低于空白对照组和溶剂对照组(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.亚慢性染毒B[a]P可损伤大鼠空间学习记忆能力。
　　 2.亚慢性染毒B[a]P能诱导大鼠海马神经细胞凋亡;B[a]P诱导BAX表达水平升高、抑制BCL-2表达，导致BCL-2/BAX比值下降，诱导Caspase3、Caspase6蛋白表达水平升高，导致Caspase3、Caspase6、Caspase9活性升高，可能与其诱导海马神经细胞凋亡机制有关。
　　 3.亚慢性染毒B[a]P可抑制PKA、ERK1/2、CREB蛋白磷酸化水平，可能是其损害大鼠空间学习记忆能力的机制之一;B[a]P抑制PKA基因mRNA和蛋白表达，可能与PKA、ERK1/2、CREB蛋白磷酸化水平下降有关。

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声明

论文说明

摘要

英文缩略词

前言

第一章 苯并[a]芘对大鼠的空间学习记忆能力影响研究

材料与方法

结果

讨论

结论

第二章 亚慢性染毒B[a]P对大鼠海马神经细胞凋亡相关基因和蛋白表达水平及活性的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

第三章 亚慢性染毒B[a]P对大鼠海马PKA/ERK/CREB信号通路的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

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