内侧隔核注射淀粉样β蛋白对大鼠认知功能的影响及其机制研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)又称老年性痴呆，是近百年来最常见的一种神经退行性疾病。AD起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型，约占痴呆症总数的60％-80%。AD发病率较高，据统计，全世界65岁以上的老人中约有6%患有AD，并且AD的发病率还在持续上升。预测到2050年，每85个人中就有一个AD的患者。AD最典型的病变是认知功能的损害，包括学习能力下降和记忆力减退，也伴有精神和行为障碍。大量动物实验研究发现，AD模型动物具有认知和行为学上的明显缺陷。例如，在Y迷宫实验中，AD模型动物会表现出对新奇环境的探索明显减少；在水迷宫实验中，AD模型动物与对照组相比学习寻找隐藏的水下平台和准确记忆平台位置都会出现明显的缺陷。
　　AD典型的病理表现是基底前脑胆碱能神经元的大量丢失。内侧隔核（Medialseptum，MS）是基底前脑的一个重要的胆碱能系统结构，胆碱能神经元是MS中最重要的神经元，GABA能神经元也是MS中重要的神经元，两者都有相应的神经纤维投射到海马。海马是大脑边缘系统的重要结构，与学习和记忆过程有密切联系。有实验研究显示内侧隔核中胆碱能神经元在空间学习记忆中起着重要作用，如果损伤内侧隔核与海马之间的纤维投射会导致记忆能力的严重损伤。AD的另一病理特征是脑内老年斑的沉积。老年斑的主要成分是淀粉样β蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ），其具有广泛的神经毒性作用，也能特异性损伤基底前脑胆碱能神经元。目前已发现，Aβ多种片段如Aβ25-35，Aβ31-35等都具有相似的神经毒性，都能特异性损伤胆碱能神经元。同时也有报道表明，海人藻酸（KA）能特异性损伤GABA能神经元。然而，MS注射Aβ或KA后对脑的高级认知功能有何影响及其化学和电生理机制，例如MS中胆碱能神经元或GABA能神经元的贡献以及海马突触可塑性的变化，仍不十分清楚。
　　因此本实验将具有神经毒性作用的Aβ25-35或KA注射到MS，以特异性损伤MS中胆碱能神经元或GABA能神经元。在此基础上，利用经典的Morris水迷宫、对位水迷宫、Y迷宫和在体电生理技术观察了MS注射Aβ25-35或KA对大鼠空间学习、记忆、探索能力以及海马突触可塑性的影响，旨在寻找Aβ的作用靶点，为探讨AD病因提供新思路。实验具体分以下两部分：
　　第一部分：内侧隔核注射Aβ对大鼠认知功能的损害
　　目的：本实验利用Morris水迷宫测试大鼠空间参考学习记忆功能，利用对位水迷宫测试大鼠认知能力的可塑性，利用Y迷宫测试大鼠空间探索动机，观察了内侧隔核注射Aβ25-35或KA后，大鼠在不同迷宫中的行为学表现，探讨Aβ25-35或KA注射到内侧隔核后损伤大鼠高级认知功能的可能机制。
　　方法：实验选用正常成年雄性SD大鼠（250-280g）30只，随机分为三组：生理盐水组（对照组）、Aβ25-35组和KA组。在脑立体定位仪指引下行内侧膈核药物注射。手术恢复14天后，先进行Morris水迷宫定位航行和空间探索实验，随后进行对位水迷宫定位航行和空间探索实验，之后再进行Y迷宫空间探索能力测试。水迷宫试验的主要指标有：大鼠寻找水下平台的平均潜伏期、游泳距离、撤除平台后大鼠在目标象限游泳时间（总时间限定为120秒）和距离、游泳速度。Y迷宫测试的主要指标为大鼠在各个不同臂中停留时间占总时间（5分钟）的百分比。各种药物均由内侧隔核给予。
　　结果：（1）对照组大鼠学习记忆功能正常，逃避潜伏期在定位航行实验的第1、2、3、4、5天分别是92.99±3.55s,54.81±3.99s,38.37±1.97s,23.15±1.74sand16.21±1.54s；相应的大鼠找到隐藏平台所游过的距离分别是1112.65±100.17cm，527.73±37.34cm，370.08±46.82cm，212.12±48.86cmand208.08±19.31cm；撤去平台后，在空间探索实验中对照组大鼠在目标象限游过的时间和距离占总时间和距离的百分比分别为44.86±1.46%和42.28±1.08%。(2)内侧隔核注射5nmolAb25-35后，定位航行实验第2-5天的平均潜伏期与对照组相比明显延长，分别为93.49±3.70s(P＞0.05),69.03±4.00s(P＜0.01),51.65±4.09s(P＜0.01),39.49±2.34s(P＜0.01)和30.50±2.18s(P＜0.01)，相应的游泳距离与对照组相比也明显延长1216.91±102.66cm(P>0.05)，839.33±82.12cm(P<0.01)，721.85±72.75cm(P＜0.01)，508.79±40.21cm(P＜0.01)and469.12±29.44cm(P＜0.01)；撤去平台后，大鼠空间探索实验中在目标象限游泳所用的时间和游泳的距离占总时间和距离的百分比明显比对照组比例低，分别为22.62±1.01%(P＜0.01)和24.22±1.32%(P＜0.01)。（3）内侧隔核注射0.75μg/μlKA后，定位航行实验的平均潜伏期和游泳距离以及空间探索实验目标象限的百分比与对照组相比均无明显差异。（4）在对位水迷宫试验中，对照组大鼠学习记忆功能的灵活性正常，连续4天定位航行实验逃避潜伏期分别为：32.02±3.52s,18.81±1.82s,18.34±2.04s和16.38±1.84s；相应找到隐藏平台所游过的距离分别是406.54±83.39cm,266.19±10.29cm,241.78±7.83cmand216.82±8.82cm；对位水迷宫空间探索实验中，大鼠在目标象限游过的时间和距离占总时间和距离的百分比分别为42.15±1.33%and41.6±0.95%。（5）内侧隔核注射5nmolAb25-35的大鼠学习记忆灵活性明显受损，对位水迷宫定位航行实验前四天的平均潜伏期与对照组相比明显延长，分别为58.48±6.62s(P＜0.01),42.74±5.48s(P＜0.01),34.96±4.18s(P＜0.01)和31.25±3.88s(P＜0.01)，相应的游泳距离876.68±21.95cm(P＜0.01),549.46±29.79cm(P＜0.01),509.28±25.99cm(P＜0.01)和468.43±28.62cm(P＜0.01)，空间探索实验大鼠在目标象限游过的时间和距离占总时间和距离的百分比分别为21.88±0.83%(P＜0.01)and22.64±0.65%(P＜0.01)，与对照组相比百分比明显降低。（6）内侧隔核注射0.75μg/μlKA，定位航行实验的平均潜伏期和游泳距离以及空间探索实验目标象限的百分比与对照组相比均无明显差异。（7）内侧隔核注射生理盐水5nmol的大鼠，在Y迷宫试验中新奇臂内探索百分比明显高于其他两臂，为40.13±3.64%。（8）内侧隔核注射5nmolAb25-35的大鼠，新奇环境探索能力明显下降，在新奇臂内停留时间百分比为21.22±1.185%，P＜0.01。（9）内侧隔核注射0.75μg/μlKA，对于新奇环境的探索能力也明显降低，仅占总时间的23.10±1.27%，P＜0.01。（10）各实验组动物在可视平台实验中逃避潜伏期和游泳速度均无明显差异。
　　结论：内侧隔核注射Ab25-35能够损害大鼠经典Morris水迷宫中的空间学习记忆能力，对位水迷宫中学习记忆的灵活性，以及Y迷宫中对新奇环境的探索能力。内侧隔核注射KA则不影响大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力以及学习记忆的灵活性，但可伤害大鼠Y迷宫试验中对于新异环境的探索能力。鉴于以上实验结果，考虑到内侧隔核是脑内胆碱能和GABA能神经元较为集中的核团，并且Ab能特异性损害胆碱能神经元、KA能特异性损伤GABA能神经元，我们推测，MS注射Ab造成的空间学习记忆和探索动机伤害可能是MS中胆碱能神经元损伤所导致的。因此，本研究为AD胆碱能假说提供了有力的行为学证据，提示MS-海马投射极有可能是神经毒性Ab的一个重要靶点。
　　第二部分：内侧隔核注射Aβ对在体大鼠海马LTP的压抑
　　目的：本实验通过给予Schaffer侧支高频刺激以诱导在体大鼠海马CA1区长时程增强（longtermpotentiation,LTP）,观察了隔核注射Aβ25-35或KA对CA1区基础的突触传递和高频刺激诱导的LTP的变化情况，从电生理角度阐明Aβ伤害认知功能的机制。
　　方法：实验采用行为学试验之后的SD大鼠（280-300g），麻醉后将其固定于颅脑定位仪上，根据SD大鼠海马的立体定位坐标，将同心圆双电极刺激电极和记录电极精确插入到海马CA1区的刺激和记录部位。通过给予海马Schaffer侧支单个电刺激、双脉冲刺激和强直电刺激，在海马CA1区放射层诱发和记录基础的场兴奋性突触后电位（fieldexcitatorypostsynapticpotentials，fEPSPs）、双脉冲易化（pairedpulsefacilitation,PPF）以及fEPSP的长时程增强即LTP。观察内侧隔核注射Ab25-35或KA后，fEPSPs、LTP以及PPF的变化情况。
　　结果：（1）给予HFS后，对照组fEPSPs幅度从100%的基础值即刻上升到202.83±4.66%，一个小时后仍可保持在158.79±4.39%；（2）隔核Aβ25-35注射不影响基础性突触传递，但对于高频刺激引起的LTP具有明显的压抑作用，给予HFS后0min、30min、60min时fEPSPs幅度即刻只上升到162.65±2.65%(p＜0.01)，30min和60min时降低至118.51±2.90%(p＜0.01)和111.37±2.51%(p＜0.01)，明显低于对照组；（3）隔核注射KA后，平均的fEPSPs幅度在HFS后0min，30min，60min时分别为207.90±4.26%,164.43±3.13%和157.36±4.11%，与对照组无明显差异；（4）对照组、Aβ25-35组和KA组大鼠的基础fEPSP均无明显差异，提示，各药物均不影响基础的突触传递；（5）实验中各组PPF均无显著差异，提示所用Aβ25-35和KA药物影响LTP主要不是通过突触前机制实现的。
　　结论：内侧隔核注射Aβ25-35能够明显压抑大鼠海马CA1区在体LTP的诱导和维持，而KA对于大鼠海马CA1区在体LTP的诱导和维持无明显影响。结果提示，MS注射Aβ25-35引起的认知功能损害可能与海马突触可塑性的下调有关。结合我们以前的实验及他人研究结果，内侧隔核胆碱能神经元向海马的投射，特别是胆碱能神经元投射的损伤可能与CA1区LTP的损伤密切相关。因此本研究为MS中Aβ的沉积及其毒性作用机制提供了电生理学证据。

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Part Ⅰ：Medial Septum Injection of A?25-35 Impairs Advanced Cognition of Rats

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INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

参考文献

Part Ⅱ:Medial Septum Injection of A?25-35 Impairs Long Term Potentiation in the Rat Hippocampal CA1 Region in vivo

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MATERIALS AND METHODS

RESULTS

DISCUSSION

参考文献

综述

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