AMPA受体外化在铝致大鼠海马LTP损害中的作用及其信号转导机制研究

摘要

第一部分、急性、亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP损害作用及对AMPA受体外化的影响 从本课题组的前期研究结果发现，在亚慢性染铝致大鼠学习记忆损害的动物模型中，海马细胞内AMPA受体亚单位的表达量降低，说明AMPA受体与铝损害学习记忆的机制有关。同时AMPA受体作为LTP的主要表达机制，我们有理由认为AMPA受体可能是铝损害LTP机制之一。所以，本项目拟通过急性和亚慢性铝暴露，观察不同剂量铝对大鼠海马LTP的影响，以及在损害LTP的情况下，AMPA受体外化（AMPA受体亚基GluR1、GluR2分别在胞膜和总蛋白中蛋白表达量）的改变，为阐明铝损害LTP的机制研究提供有力的实验依据。 第一章、急性铝暴露对大鼠海马LTP的影响 目的:探讨急性铝暴露对大鼠海马LTP的影响。 方法:对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43ug Al(mal)3、12.15 ug Al(mal)3和60.75 ug Al(mal)3，给药容积为5ul，5min内缓慢匀速注入。采用在体海马CA1区LTP及PPF记录技术，记录fEPSP。 结果:各个剂量组在给药前和给药后5min、15min、30 min的fEPSP幅度变化不大，无统计学差异(P＞0.05）;侧脑室内注射生理盐水及不同剂量Al(mal)3后不影响PPF，与注射前相比没有显著性差异(P＞0.05)，Al(mal)3未对突触前释放产生影响;对照组在高频刺激后fEPSP即刻增大至(221±10)％，1h后仍保持在(190±27)％，但注射了Al(mal)3的中高剂量组在在高频刺激后fEPSP即刻增大的幅度仅为（165±21）％和（149±8）％，在1h之后，中剂量组fEPSP幅度仅保持在（140±13）％，高剂量组fEPSP幅度几乎回到了高频刺激前的基础水平（110±7）％，与对照组组比显著降低(P＜0.05)，低剂量组虽然在高频刺激后fEPSP即刻增大的幅度达到了（194±19）％，与对照组无差别(P＞0.05)，但在30min及1h后，幅度降低到了（164±13）％和（157±8）％，比对照组明显降低，由此可见，Al(mal)3对LTP的诱导与维持的抑制成明显的剂量依赖性。 结论:Al(mal)3对LTP的诱导与维持的有明显的抑制作用，并呈现出显著的剂量依赖性，这可能与铝损害突触后机制（如，NMDAR、AMPAR等谷氨酸受体）有关。 第二章、急性铝暴露对大鼠海马AMPA受体外化的影响 目的:探讨急性铝暴露对海马AMPA受体外化的影响。 方法:对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43ug Al(mal)3、12.15 ugAl(mal)3和60.75 ug Al(mal)3，给药容积为5ul，5min内缓慢匀速注入。在电生理实验结束后断头取海马，分别提取总蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法检测AMPA受体亚单位GluR-1、GluR-2的蛋白表达水平。 结果:总蛋白中，低、中、高染铝组上述两种亚单位的蛋白表达量无变化，且与对照组相比，无统计学差异(P＞0.05);膜蛋白中，低、中、高染铝组上述两种亚单位的蛋白表达量呈逐下降的趋势，且与对照组相比，有统计学差异(P＜0.05)。 结论:急性铝暴露未影响AMPA受体的蛋白合成，但抑制了AMPA受体从胞浆向胞膜的转运（外化）。 第三章、亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP的影响 目的:探讨亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP的影响。 方法:健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组:生理盐水、低剂量组Al(mal)3（0.41 mg/kg）、中剂量组Al(mal)3（0.82mg/kg）与高剂量组Al(mal)3（1.23mg/kg），腹腔注射染毒8周后，采用在体海马CA1区LTP记录技术，记录fEPSP。 结果:对照组在高频刺激后fEPSP即刻增大至（191±9）％，30min时保持在（154±15）％，60min后降低到（139±12）％;低剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1 min、30min、60min时的幅度分别为（195±17）％、（153±21）％和（131±18）％，与对照组比较，无统计学差异(P＞0.05);中剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1 min、30min、60min时的幅度分别为（176±21）％、（132±20）％和（117±7）％，与对照组比较，30min、60min时的幅度有统计学差异(P＜0.05)，与低剂量组比较30min时的幅度有统计学差异(P＜0.05);高剂量组fEPSP幅度在高频刺激后1 min、30min、60min时的幅度分别为（175±40）％、（106±5）％和（85±10）％，与对照组比较，30min、60min时的幅度有统计学差异(P＜0.05)，与低剂量组比较30min、60min时的幅度有统计学差异(P＜0.05)，与中剂量组比较30min、60min时的幅度有统计学差异(P＜0.05)。 结论:亚慢性铝暴露对大鼠海马CA1区LTP呈显著的抑制作用，并成一定的剂量依赖性。 第四章、亚慢性铝暴露对大鼠海马AMPA受体蛋白外化的影响 目的:探讨亚慢性铝暴露对海马AMPA受体外化的影响。 方法:健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组:生理盐水、低剂量组Al(mal)3（0.41 mg/kg）、中剂量组Al(mal)3(0.82mg/kg)与高剂量组Al(mal)3(1.23mg/kg)，腹腔注射染毒8周，在电生理实验结束后断头取海马，分别提取总蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法检测AMPA受体亚单位GluR-1、GluR-2的蛋白表达水平。 结果:总蛋白中，高剂量组GluR-1蛋白表达量且与对照组相比，显著降低(P＜0.05)，中、高剂量组的GluR-2蛋白表达量与对照组比较明显降低(P＜0.05)，且高剂量组的GluR-2蛋白表达量与低剂量组相比降低明显(P＜0.05);膜蛋白中，两种亚单位的蛋白表达量随着染毒剂量的增加呈逐渐下降的趋势，中、高剂量组GluR-1、 GluR-2蛋白表达量且与其对照组相比，显著降低(P＜0.05)，且高剂量组的GluR-1蛋白表达量与低剂量组相比降低明显(P＜0.05)。 结论:亚慢性铝暴露不但抑制了AMPA受体从胞浆向胞膜的转运（外化），而且也抑制了AMPA受体的合成。 第二部分、铝损害AMPA受体外化的信号转导机制研究 从本文第一部分的研究结果来看，AMPA受体参与铝损害大鼠海马LTP的发生机制，而其信号转导机制还不清楚。本部分研究拟采用在体电生理技术、western-blot和ELISA方法观察在急性铝暴露的情况下，伴随LTP损害情况下，RAS、MAPK、PI3K通路各个信号分子的表达情况，以及使用RAS活化剂的情况下，LTP及各个信号分子的变化。通过此次研究初步阐明AMPA受体外化在铝损害大鼠海马LTP中的作用及其信号转导机制，为铝致学习记忆损伤的机制研究及未来的干预研究提供有力的依据。 第一章、RAS在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究 第一节、急性铝暴露对大鼠海马RAS活性的影响 目的:探讨急性铝暴露对大鼠海马RAS蛋白活性的影响。 方法:对照组、低、中、高染铝组大鼠通过侧脑室给药的方式分别一次性接受生理盐水、2.43ug Al(mal)3、12.15 ugAl(mal)3和60.75 ug Al(mal)3，给药容积为5ul，5min内缓慢匀速注入。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定RAS蛋白活性。 结果:随着染铝剂量的增加，RAS活性呈逐渐下降的趋势，经统计学分析，与对照组比较，中、高剂量组的RAS活性显著下降(p＜0.05)。 结论:急性铝暴露会抑制RAS蛋白的活性，RAS活性的降低可能与铝损害LTP有密切关系。 第二节、RAS活化剂EGF在铝致大鼠LTP损害中的拮抗作用研究 目的:探讨RAS活化剂EGF在铝致大鼠LTP损害的拮抗作用。 方法:健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组:对照组（生理盐水）、EGF组，、Al+EGF组与Al组。采用侧脑室注射的方式一次性给予对照组大鼠5ul生理盐水，给予EGF组大鼠60ngEGF，给予Al+EGF组大鼠12.15ugAl和60ngEGF，给予Al组大鼠12.15ugAl。采用在体海马CA1区LTP记录技术，记录fEPSP。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定RAS蛋白活性。 结果:高频刺激后，对照组fEPSP幅度立即升高到（191±25）％，30min时保持在（179±22）％，60min后仍能保持在（156±27）％，而单纯染铝组fEPSP幅度在1min时为（160±4）％，在30min时持续下降到（132±15）％，而到60min时已完全恢复致基线水平（115±12）％，说明12.15ugAl显著的抑制了LTP的诱导和维持，这与我们第一部分第一章的结果相一致。EGF作为RAS的活化剂，我们在观察它是否会拮抗Al对LTP的抑制作用之前，我们首先观察了单独使用EGF是否会引起LTP的变化。结果显示，60ngEGF组高频刺激后fEPSP幅度在1min、20min时分别是（224±28）％和（189±14）％，与对照组比较幅度升高很明显(p＜0.05)，但到了30min、40min、60min时，fEPSP幅度与对照组一致，无明显差别(p＞0.05)。此结果显示，EGF可以增强早期的LTP诱导，但到了后期作用减弱。最后我们联合使用了12.15ugAl和60ng EGF，结果我们惊喜的发现，EGF可以拮抗Al导致的LTP损害，在高频刺激后的1min、20min时，12.15ugAl+60ng EGF组fEPSP幅度分别为（183±5）％和（158±15）％，与单独使用12.15ugAl组比较，有了明显的上升(p＜0.05)，但到了30min、40min、60min时，fEPSP幅度与12.15ugAl组一致，无明显差别(p＞0.05)。此结果说明EGF可以拮抗Al对LTP诱导的早期损害，但到了后期，这种拮抗作用减弱。 结论:RAS活化剂的EGF可以拮抗急性铝暴露致LTP早期损害作用，急性铝暴露致大鼠海马LTP损害与RAS蛋白活性降低有关。 第二章、PI3K/PKB通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究 目的:探讨PI3K/PKB通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用。 方法:健康成年雄性SD大鼠24只，按体重随机分为4组:对照组（生理盐水）、EGF组，、Al+EGF组与Al组。采用侧脑室注射的方式一次性给予对照组大鼠5ul生理盐水，给予EGF组大鼠60ngEGF，给予Al+EGF组大鼠12.15ugAl和60ngEGF，给予Al组大鼠12.15ugAl。在电生理实验LTP测定结束后，断头取海马提蛋白，采用ELISA法测定PKB蛋白活性，采用western-blot法测定GluR1 S831和S845位点磷酸化水平。 结果:与对照组比较，单独给予12.15ugAl后，PKB活性明显下降(p＜0.05)，单独给予60ng EGF后，PKB活性明显升高(p＜0.05)，当联合给予12.15ug Al和60ng EGF后，与单独染铝组相比，PKB活性又有明显的回升(p＜0.05);与对照组比较，单独给予12.15ugAl后，GluR1 S831和S845位点磷酸化水平明显下降(p＜0.05)，单独给予60ng EGF后，其磷酸化水平明显升高(p＜0.05

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论文说明

摘要

英文缩写

前言

第一部分 急性、亚慢性染铝对大鼠海马LTP的损害作用及对AMPA受体外化的影响

第一章 急性染铝对大鼠海马LTP的影响

第二章 急性铝暴露对大鼠海马AMPA受体外化的影响

第三章 亚慢性铝暴露对大鼠海马LTP的影响

第四章 亚慢性铝暴露对大鼠海马AMPA受体蛋白外化的影响

小结

第二部分 铝损害AMPA受体外化的信号转导机制影响

第一章 RAS在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究

第一节 急性铝暴露对大鼠海马RAS活性的影响

第二节 RAS活化剂EGF在铝致大鼠LTP损害中的拮抗作用研究

第二章 PI3K／PKB通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究

第三章 MAPK／ERK通路在铝致大鼠LTP损害过程中的作用研究

小结

总结

参考文献

综述 AMPA受体运输相关蛋白研究进展

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