抑制Evi1基因表达促进BMSCs成骨分化治疗骨质疏松症的研究

摘要

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。随人类寿命的延长和社会老年化的到来，骨质疏松症已成为人类重要的健康问题。
　　目前对骨质疏松的治疗措施主要分为基础措施和药物治疗两个方面。基础治疗措施中主要是补充钙剂和维生素D。药物治疗主要包括抗骨吸收药物、促骨形成药物和其他药物。但由于对骨质疏松的发病机制并不完全清楚，所以当前对于骨质疏松的治疗并不理想。因此，进一步研究骨质疏松形成机制以及寻求更好的治疗方法，降低骨折发病率和提高生活质量是当前骨质疏松治疗研究的重点。
　　骨质疏松发病机制有很多，目前也取得了很多进展。近年来有越来越多的证据证明骨质疏松与骨髓间充质干细胞的相对缺乏相关；而且大量的研究发现患有骨质疏松的绝经期女性与正常女性相比不但常常伴有骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的降低，同时伴有骨髓组织中脂肪成分的增加。那么也就是说骨髓间充质干细胞成脂分化能力的增加也可能是骨质疏松的发病机制。是不是抑制了骨髓间充质干细胞的成脂分化就能在一定程度上缓解骨质疏松的进程。
　　要抑制骨髓间充质干细胞向脂肪分化，我们首先要明确骨髓间充质干细胞成脂分化的关健调控因素。国外学者发现异位病毒整合位点1（ectopic viral integration site，Evi1）是前脂肪细胞3T3-L1分化为成熟脂肪细胞的决定因素；干扰该基因的表达则会阻断3T3-L1细胞向成熟脂肪细胞分化的进程。骨髓间充质干细胞可以分成为脂肪细胞，也可视为一种前脂肪细胞，异位病毒整合位点也应该会决定其向脂肪细胞分化的过程。基于以上，提出三点假设：在骨髓间充质干细胞的成脂肪分化过程中存在Evi1基因的表达；Evi1基因决定骨髓间充质干细胞的成脂肪分化；抑制Evi1基因的表达可以促进骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化。
　　本实验从细胞研究及动物实验两个方面对以上问题展开了研究工作，研究内容主要包括以下四个部分：
　　1、提取骨髓间充质干细胞并进行培养和鉴定。
　　2、在干细胞成脂分化过程中研究Evi1基因的表达以及如何表达。
　　3、构建腺病毒载体，采用RNA干扰技术转染骨髓间充质干细胞并测定其干扰效率和干扰作用。
　　4、制作大鼠骨质疏松模型，通过尾静脉注射腺病毒转染的骨髓间充质干细胞，观察对骨质疏松的治疗效果。
　　第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定
　　目的：
　　学习并掌握大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养技术，并进行细胞形态学、细胞增殖、细胞表面标记物、成骨成脂诱导分化的鉴定。为进一步的实验提供研究基础。
　　方法：
　　1.实验动物
　　雌性SPF级Sprague Dawley（SD）大鼠，体重100-120g,由中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心提供。
　　2．大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的原代分离培养
　　5％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，无菌条件下快速取大鼠的股骨及胫骨，去除肌肉等软组织，PBS清洗干净。剪掉长骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100U/ml青、链霉素和10%FBS的L-DMEM培养基冲洗骨髓腔，直至骨质发白；将冲出的骨髓内容物分置于培养瓶中，每只动物骨髓可接种两个T25培养瓶，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。
　　3.BMSCs的培养、纯化及传代
　　在原代培养过程中，24小时后更换全部培养基，以后每周更换两次完全培养液，待细胞铺满培养皿约90%时，使用胰酶-EDTA溶液消化，1:4/5的比例进行传代培养。
　　4.BMSCs的形态学检查
　　培养后使用倒置显微镜观察细胞的形态变化以及生长情况，并进行拍照。
　　5.流式细胞术测定的细胞表面标记物表达
　　取第3代生长状态良好BMSCs，胰酶-EDTA溶液消化，1000转/分钟离心5分钟，倒置显微镜下计数细胞，依次在各管中加入单克隆抗体 CD34, CD44, CD45和CD904℃条件下孵育30分钟，用PBS液洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，与FITC标记和PE标记的二抗避光作用30分钟，再用PBS液重悬细胞并置于冰上，上流式细胞仪进行检测分析。
　　6. BMSCs的成骨成脂诱导分化能力
　　取第3代生长良好的BMSCs，接种于6孔细胞培养板，待细胞贴壁生长至细胞密度达80-90%时，在各诱导孔的完全培养液中分别加入成骨细胞诱导剂和成脂细胞诱导剂，各诱导孔每3-4天换液1次，同时设置L-DMEM完全培养液的细胞培养孔作为空白对照。成骨细胞诱导剂诱导16天后，室温下4%多聚甲醛固定10分钟，对诱导分化的成骨细胞进行茜素红染色；成骨诱导时细胞密度要求达到100%，成脂细胞诱导剂诱导21天后，4%多聚甲醛固定，对诱导分化的脂肪细胞进行油红O染色。倒置显微镜下观察并拍照。
　　结果：
　　1.BMSCs的形态学观测
　　SD大鼠骨髓间充质干细胞形态主要呈梭形细胞，细胞集落呈放射状排列，细胞长势良好，可稳定传代20代以上。
　　2.BMSCs表面标记物的表达
　　SD大鼠骨髓间充质干细胞CD44、CD90均呈阳性表达，而CD34、CD45呈阴性表达。
　　3.BMSCs成骨成脂诱导分化鉴定
　　经成骨、成脂诱导分化后，分别用茜素红染色和油红O染色均呈阳性。
　　结论：
　　全骨髓贴壁培养法操作步骤简单，能够大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞，获得的细胞具有骨髓间充质干细胞的形态学及生物学特性，经诱导分化培养后有成骨和成脂分化潜能。
　　第二部分 Evi1基因在骨髓干细胞成脂分化中的表达
　　目的：
　　在体外通过成熟的骨髓间充质干细胞成脂诱导方法诱导其成脂分化，使用PCR和Western blotting方法检测Evi1基因的表达。
　　方法：
　　1.细胞
　　传至第3代全骨髓贴壁培养法提取的骨髓间充质干细胞。
　　2.引物设计与合成
　　引物设计与合成由大连宝生物公司协助完成。
　　3.骨髓间充质干细胞体外成脂诱导分化
　　细胞接种于60mm培养皿中48小时，然后加入含200μM吲哚美辛，1μM地塞米松，0.5mM IBMX,和0.5μg/ml胰岛素的成脂诱导培养基培养细胞，每周更换两次培养基。正常骨髓干细胞为对照组。
　　4. Real-time PCR测定Evi1基因的表达
　　在加入诱导培养基后连续10天中每日提取细胞总RNA，按照说明书将提取的RNA在一定的化学反应体系以及反转录条件下合成cDNA,加入到1μl cDNA与上游引物、下游引物、水及SYBR? Premix Ex Taq在CFX96?Real-Time PCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线以及溶解曲线。并相对定量计算实验结果（2-ΔΔCT法）。
　　5. Western blotting测定Evi1基因的蛋白含量
　　在加入诱导培养基后连续10天中每日提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。配制10%SDS-PAGE凝胶，上样（上样量均为25μg/孔）、电泳、转膜、封闭、经过一抗、二抗反反应后，进行化学发光，利用Image J软件进行条带分析。用目的蛋白的灰度值除去内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白的相对含量。
　　结果：
　　与正常培养的骨髓干细胞相比，Evi1基因在骨髓间充质干细胞成脂分化前五天存在一过性高表达，并在第三天达到高峰。
　　结论：
　　通过成熟的骨髓干细胞成脂诱导培养方法成功诱导干细胞的成脂分化，并在这一过程中运用Real-time PCR和Western blotting分别从Evi1基因mRNA和蛋白水平进行检测，验证了本本实验的第一个假设。为下一步实验的进行奠定了基础。
　　第三部分腺病毒载体构建以及Evi1基因在骨髓间充质干细胞成脂分中的作用
　　目的：
　　以腺病毒为载体，体外构建Evi1基因的干扰质粒，对骨髓干细胞进行转染并检测细胞的转染效率和转染后对骨髓间充质干细胞成脂、成骨分化的影响。为基因治疗骨质疏松探索新的药物靶点。
　　方法：
　　1.干扰序列的设计与合成
　　大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423.1），分别针对第149和1423位点为起点人工合成2条siRNA序列，绿色荧光蛋白序列作为阴性对照。
　　2.重组腺病毒的构建与包装
　　选择限制性内切酶（BgL2和HindIII）将上述目的片断定向克隆入穿梭载体pAd-Track-U6；挑取较小的克隆，接种到含卡那霉素的5ml LB液体培养基中，250转/分钟，37℃培养过夜，提取质粒；提取的穿梭质粒用PmeI对阳性质粒进行线性化，通常酶切过夜；电转化重组，取线性化的穿梭载体与腺病毒骨架载体充分混合，然后加入到电转杯中，放入电转仪进行电转化；挑取较小的单克隆，10到15个，接种到含卡那霉素的5ml液体LB培养基中，培养过夜；提取质粒，选取3到4个质粒进行酶切，用PacI进行酶切，然后电泳检测筛选阳性质粒；将鉴定正确的质粒按照Lipofectmine2000转染试剂要求，转染293A细胞，收集细胞及培养液反复冻融后2000g离心收集上清；再次感染293A细胞，重复这一过程以增加病毒滴度；浓缩、纯化重组腺病毒；透析纯化病毒悬液；测定重组腺病毒的滴度。
　　3.转染BMSCs
　　取生长良好的传至第3代的骨髓间充质干细胞接种于60mm培养皿中等细胞生长至80％融合时，更换无血清L-DMEM培养基后12小时加入适量的病毒，6-8小时后更换为骨髓间充干质细胞成脂诱导培养基，24小时后在倒置荧光显微镜下观察到大量绿色荧光。
　　4.通过Real-time PCR测定干扰效率
　　在成功转染后3天提取RNA，同时提取正常培养的骨髓间充质干细胞的RNA作为对照组，按照说明书将提取的RNA在一定的化学反应体系以及反转录条件下合成cDNA，在Real-time PCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线以及溶解曲线。并相对定量计算实验结果（2-ΔΔCT）。
　　5. Real-time PCR测定RNA干扰对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
　　分别在成功转染后1、3、5和7天提取各组细胞的RNA，同时提取正常培养的骨髓间充质干细胞的RNA作为对照组，按照说明书将各组的RNA在一定的化学反应体系以及反转录条件下合成cDNA后，在Real-time PCR仪上进行扩增，记录Ct值、扩增曲线以及溶解曲线。并相对定量计算实验结果（2-ΔΔCT）。
　　6. Western blotting测定RNA干扰对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
　　分别在成功转染后1、3、5和7天提取各组细胞的蛋白，BCA测定蛋白浓度。配制10%SDS-PAGE凝胶，上样、电泳、转膜、封闭、经过一抗、二抗反应后，进行化学发光，利用Image J软件进行条带分析。用目的蛋白的灰度值除去内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果代表样品的目的蛋白的相对含量。
　　结果：
　　1.干扰序列的设计与合成
　　针对大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423.1），人工合成2条siRNA序列，分别对5’-GGAAGCAACATGGAAACAA-3’位点进行干扰的siEvi1-1：正链5’-GATCCGGAAGCAACATGGAAACAATTCAAGAGATTGTTTCCATGTTGCTTCCT TTTTTG-3’，反链5’-AGCTCAAAAAAGGAAGCAACATGGAAACAATCTCTTGAATTGTTTCCATGTT GCTTCCG-3’；和对5’-GCAGTGAGGTCTGCCATAA-3’位点进行干扰的siEvi1-2：正链5’-GATCCGCAGTGAGGTCTGCCATAATTCAAGAGATTATGGCAGACCTCACTG CTTTTTTG-3’，反链5’-AGCTCAAAAAAGCAGTGAGGTCTGCCATAATCTCTTGAATTATGGCAGAC CTCACTGCG-3’。
　　2.腺病毒干扰载体的构建与作用
　　实验成功构建了异位病毒整合位点的腺病毒干扰载体，而且对骨髓间充质干细胞感染效率高达95%，干扰效率分别达到了90.9%和72.3%。
　　3. RNA干扰对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
　　分别用Real-time PCR和Western blotting对各组1、3、5和7天的成骨分化的标志物BSP、OCN和OPN以及成脂分化的标志物PPARγ2和LPL进行检测，结果显示：RNA干扰后细胞成脂分化的标志物明显降低而细胞成骨分化的标志物明显升高。
　　结论：
　　成功构建异位病毒整合位点的RNA干扰的腺病毒载体；成功转染骨髓间充质干细胞，并且具有很高的干扰效率。验证了本实验的第二个假设，为下一步实验提供了基础。
　　第四部分 ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞缓减大鼠骨质疏松的作用
　　目的：
　　建立大鼠骨质疏松模型，在大鼠造模后7天将ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞通过尾静脉注谢的方法移植入骨质疏松模型大鼠体内，注射后28天通过比较各组的骨密度(BMD)、I型骨胶原N-末端前肽（ PINP）、I型胶原羟基未端肽（β—CTX）、和股骨生物力学指标的变化，初步得出RNAi骨髓间充质干细胞能够有效缓解骨质疏松进程。
　　方法：
　　1.实验动物
　　8周健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，体重220-250g，由北京军事医学科学院动物实验中心提供。分为四组进行实验。
　　2.建立大鼠脊髓损伤模型
　　骨质疏松模型：实验动物5%水合氯醛麻醉（0.6ml/100g,腹腔注射）；然后采用腰椎后侧正中切口，椎旁纯性分离肌肉组织，切开腹膜，进入腹腔。完整摘除双侧卵巢，给予伤口彻底的止血，逐层进行缝合，假手术组手术操作同上，仅摘除卵巢周围少许脂肪组织。
　　3.尾静脉注射ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松
　　在骨质疏松模型后7天，通过尾静脉注射的方法将ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞移植入大鼠骨质疏松模型体内，对照组分别注射正常培养的骨髓间充质干细胞和L-DMEM培养基。
　　4. ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松的检测
　　4.1、血清学测定
　　大鼠尾静脉注射治疗后28日，取各组大鼠血液5ml离心后取血清用试剂盒对成骨标志物和破骨标示物进行检测。
　　4.2、骨密度测定
　　使用双能光子骨密度仪测量整个股骨干的骨密度。
　　4.3、生物力学测定
　　取双侧股骨分别进行三点弯试验试验。
　　5.统计处理
　　实验结果以均数±标准差（Mean± SD）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
　　结果：
　　1.骨质疏松大鼠模型建立成功
　　本实验采用切除大鼠双侧卵巢这一成熟经典造模方法，术后手术组大鼠较其它组体重增加，术后切口无感染，所有大鼠均存活。
　　2.血清学测定结果
　　使用上海科敏生物科技有限公司的elisa试剂盒对大鼠骨生成指标Ⅰ型胶原N端前肽和大鼠骨吸收指标β骨胶原交联进行检测，结果显示：各组之间差异明显，治疗组优于模型组，统计学有显著性差异；RNAi组优于骨髓间充质干细胞组，差异有统计学意义。
　　3.骨密度测定结果
　　使用双能光子骨密度仪测量股骨的骨密度结果显示：两治疗组的骨密度较模型组有明显提高，差异有统计学意义，RNAi组优于骨髓间充质干细胞组；但均低于正常对照组，有统计学意义。
　　4.生物力学结果
　　三点弯试验结果显示：两治疗组生物力学测定值高于骨质疏松模型组，差异有统计学意义。
　　结论：
　　成功建立大鼠骨质疏松模型；两治疗组中的大鼠骨质疏松程度都一定程度上减轻，在缓解程度上ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞治疗组优于单纯骨髓间充质干细胞治疗组。Evi1基因有可能成为临床治疗骨质疏松症有效的药物靶点。

目录

封面

声明

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中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

1 材料和方法

2 结 果

3 结 论

4 讨 论

第二部分Evi1基因在骨髓干细胞成脂分化中的表达

1 材料和方法

2 结 果

3 结 论

4 讨 论

第三部分 腺病毒载体构建和骨髓间充质干细胞转染

1材料和方法

2 结 果

3 结 论

4 讨 论

第四部分 ShEvi1转染的骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松的作用

1 材料和方法

2 结 果

3结 论

4讨 论

参考文献

附图和表

综述:骨质疏松治疗的现状和展望

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历