兔角膜缘干细胞原代培养优化方法的初步探索

摘要

目的：
　　取新西兰大白兔的眼角膜缘组织，用DispaseⅡ与胰酶-EDTA分别在4℃与37℃冷热交替条件下进行消化，进而分离获取兔的角膜缘干细胞进行体外培养。与常规的单独使用DispaseⅡ在37℃条件下分离获取的兔角膜缘干细胞进行体外培养的方法进行比较。通过对两种不同消化方法分离获取的兔角膜缘干细胞的生物学特性的研究，探索兔角膜缘干细胞原代培养的优化方法，为眼表组织工程学的临床研究奠定更好的实验基础。
　　方法：
　　无菌操作下剪取兔的角膜缘组织，分为优化组和常规组。优化组的角膜缘组织分别在DispaseⅡ中4℃与胰酶-EDTA中37℃冷热交替条件下进行消化，常规组的角膜缘组织在DispaseⅡ中37℃条件下消化，获取角膜缘干细胞，然后制成单细胞悬液，两组都用含10％胎牛血清的KSFM培养基进行培养。通过以下3种方法进行对比：1、将单细胞悬液接种于培养瓶中，用倒置显微镜观察细胞的生长和形态特征；2、细胞传代后接种于24孔板中，进行免疫荧光染色，从而对细胞进行免疫学鉴定；3、细胞传代于6孔板上，进行结晶紫染色检测其细胞增殖能力，判断其干细胞增殖的特性。
　　结果：
　　在倒置显微镜下观察到优化组与常规组培养的兔角膜缘干细胞表现出相似的一般生长特性；细胞免疫荧光染色显示，优化组与常规组均表现为多量的ΔNp63染色，呈胞核绿染；少量的K3染色，胞质呈现的是红色染色。优化组与常规组相比较，优化组的ΔNp63阳性细胞较多（P<0.05），而角蛋白K3阳性细胞则较少（P<0.05）；结晶紫染色结果显示，优化组与常规组相比，表现出较高的克隆形成率（P<0.05），两组比较差异有显著性的意义。
　　结论：
　　用DispaseⅡ与胰酶-EDTA分别在4℃与37℃冷热交替的条件下能够成功获取角膜缘干细胞，并且在体外成功培养。这种方法缩短了常规的酶消化所需要的时间，进而减轻了长时间酶作用对角膜缘干细胞造成的潜在的损伤，为角膜缘干细胞的体外培养提供了新的方法。

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前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验对象

1.1.2主要试剂与仪器

1.2 实验方法

1.2.1液体的配制

1.2.2 LSCs的体外分离与培养

1.2.3优化组与常规组培养方法的比较

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 角膜缘干细胞形态学观察

2.2 细胞免疫荧光染色鉴定

2.3 0.1%结晶紫计算细胞克隆形成率

3 讨 论

3.1 LSCs的定位与取材

3.1.1LSCs的定位

3.1.2LSCs的取材

3.2 LSCs的培养体系的选择

3.2.1LSCs的培养方法

3.2.2LSCs体外培养基的选择

3.3 LSCs的鉴定

4 结 论

参考文献

综述:角膜缘干细胞体外培养的研究进展

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

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