阿尔茨海默病大鼠模型的磁共振、行为学、电生理、形态学和分子生物学研究

摘要

目的：
　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种严重影响老年人身体健康的中枢神经系统退行性疾病，起病隐匿，主要表现为进行性认知功能障碍、学习和记忆能力丧失，晚期出现严重的痴呆。目前我国痴呆患者的人数约600万，居世界第一位。而且随着人口老龄化的加剧，AD的发病率和患者人数还会持续增加，因此，对于 AD的早期诊断和治疗具有重要的临床意义。同时，目前临床工作中常常根据临床表现结合磁共振成像内侧颞叶萎缩视觉量表诊断AD。但是，只有中、晚期AD患者才会出现脑萎缩改变，如何在AD患者出现临床症状和脑组织形态改变之前早期发现和诊断AD，目前尚无有效方法。
　　AD的典型病理特征包括高密度老年斑、神经原纤维缠结和神经元丧失。老年斑的核心成分是由39-43个氨基酸组成的β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptides, Aβ）。大量研究表明，Aβ分子的产生和异常沉积是 AD发病的始动因素，AD病程中所出现的神经原纤维缠结的形成和神经元死亡等一系列过程，均是Aβ所引起的继发过程。此外，位于19号染色体的载脂蛋白E4（apolipoprotein E4, APOE4）基因是AD的主要危险因子，APOE4基因过表达后的产物apoE4也已经被证明具有较强的神经毒性，并与AD的发生发展有着不可忽视的关系。同时，不仅Aβ和apoE4本身具有神经毒性作用，apoE4和Aβ之间还具有协同作用，能够进一步加重AD的发生发展。
　　磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）是一种具有极高的软组织分辨力，广泛应用于神经系统疾病的研究与诊断的影像学检查手段。Morris水迷宫是在神经科学研究中广泛应用的，能够有效反映动物的认知功能改变和衡量动物学习记忆功能的经典行为学实验手段。海马长时程增强（long-term potentiation, LTP）则是研究学习记忆和AD发病机制的一个重要的电生理细胞模型。已有研究发现Aβ1-40可以直接引起大鼠侧脑室扩大、磁共振波谱成像化合物浓度改变、损伤大鼠空间学习记忆能力和压抑LTP的诱导和维持；还有研究表明人类APOE4基因目标替换小鼠的空间学习记忆能力和工作记忆能力均有不同程度的损伤，海马脑片 LTP被明显压抑。但目前仍缺乏Aβ和apoE4共同作用的影像学表现特点、对空间学习记忆能力和海马突触可塑性影响的报道，尤其是缺乏在同一动物模型先后进行磁共振、行为学、电生理和形态学等多种不同检查和实验，从不同角度阐述AD相关病变，并最终从病理学角度证实AD的相关研究。
　　本研究利用磁共振检查、Morris水迷宫行为学检测和在体场电位记录，结合相关的形态学和分子生物学检测手段，通过在造模前和造模后不同时间点检测三种不同AD模型的T2值、1H-MRS指标变化，同时观察其空间学习记忆能力和突触可塑性的改变，并最终进行病理学相关检测，探讨不同AD模型磁共振、行为学、电生理、形态学的变化及其关系。通过对三种不同AD模型先后采用多种手段从不同角度检测其AD相关病变，特别是观察不同AD大鼠模型磁共振影像学变化特点，希望有助于进一步认识AD病程中各种病变的发生发展及其相互联系，从而为AD早期诊断的准确性和敏感性提供新的依据和方法。
　　方法：
　　以侧脑室单独注射Aβ1-40或apoE4、以及联合注射Aβ1-40和apoE4三种方法制备的AD模型大鼠为研究对象。将60只大鼠随机分为空白对照组、Aβ1-40组、ApoE4组和联合给药组，每组15只。利用磁共振多回波序列和波谱成像技术，在给药前、给药后2周和4周对四组大鼠分别进行头颅MRI扫描，纵向研究大鼠海马T2值和1H-MRS化合物浓度的变化。利用Morris水迷宫行为学技术，在第二次磁共振检查结束后，对各组大鼠进行定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验，观察大鼠搜索水下平台的平均逃避潜伏期和游泳距离、在目标象限游泳的时间和距离占总游泳时间和距离的百分比，以及平均游泳速度和寻找可视平台的逃避潜伏期等指标的变化。在水迷宫实验结束后，使用在体场电位记录手段直接记录各组大鼠海马CA1区基础fEPSPs、PPF和LTP等指标的变化，以观察各组基础突触传递和突触可塑性的变化特征。在第三次磁共振检查结束后，从各组随机选取部分大鼠进行HE染色和免疫组织化学检测，从整体上观察各组大鼠脑的形态学改变，并观察海马和皮层Aβ免疫阳性细胞的数量。同时，从各组随机选取部分大鼠，采用western blot技术检测其海马组织磷酸化tau蛋白的含量。
　　结果：
　　利用磁共振多回波序列和波谱成像技术，在给药前后不同时间点对四组大鼠分别进行头颅MRI扫描，发现：（1）三种AD模型大鼠海马T2值改变特点不同。在给药前及给药后2周和4周，对照组 T2值分别为80.46±3.06 ms、81.92±3.48 ms和80.72±3.47 ms，ApoE4组的T2值则分别为80.64±2.27 ms、81.20±1.67 ms和81.98±3.10 ms。ApoE4组大鼠海马 T2值与对照组在不同时间点均无明显差异，且不同时间点ApoE4组T2值也无差异。Aβ1-40组的 T2值在给药前及给药后2周和4周分别为81.70±3.10 ms、80.59±3.22 ms和91.05±3.10 ms。在给药前和给药后2周，Aβ1-40组与对照组 T2值均无明显差异。但在给药后4周，Aβ1-40组 T2值明显高于对照组（P<0.05）。同时，Aβ1-40组大鼠在给药后4周的T2值明显高于本组给药前和给药后2周（P<0.05）。在联合给药组，给药前及给药后2周和4周，海马T2值分别为80.86±2.74 ms、81.71±3.55 ms和95.95±1.25 ms。给药后2周，三种AD模型大鼠的T2值与对照组均无显著性差异；但在给药后4周，联合给药组的T2值不仅明显高于对照组，也高于单独给予Aβ1-40或apoE4组（P<0.05）。同时，联合给药组在给药后4周的 T2值明显高于给药前和给药后2周（P<0.05）。（2）三种 AD大鼠模型海马NAA/Cr+Cr1均减低，但程度不同。给药前，对照组、Aβ1-40组、ApoE4组及联合给药组的NAA/Cr+Cr1分别为1.19±0.06、1.15±0.12、1.16±0.05和1.16±0.07；在给药后2周，Aβ1-40组、ApoE4组及联合给药组的NAA/Cr+Cr1分别为0.74±0.13、0.92±0.17和0.33±0.12，均较对照组的1.16±0.04降低（P<0.05）；给药后4周，Aβ1-40组、ApoE4组及联合给药组的 NAA/Cr+Cr1分别为0.44±0.04、0.73±0.04和0.18±0.02，同样均较对照组的1.20±0.10降低（P<0.05）；且在给药后不同时间点，均以联合给药组降低最显著，ApoE4组降低最少。同时，三种AD大鼠模型在给药后4周的NAA/Cr+Cr1均低于给药后2周，给药后2周的NAA/Cr+Cr1又低于给药前（P<0.05）。（3）三种AD大鼠模型均有海马 Cho/Cr+Cr1减低，但特点不同。在对照组，给药前及给药后的2周和4周，Cho/Cr+Cr1分别为1.30±0.13、1.27±0.08和1.28±0.05。在Aβ1-40组、ApoE4组及联合给药组，给药后2周和4周海马 Cho/Cr+Cr1分别为1.01±0.31和0.81±0.16、0.95±0.25和0.84±0.09、0.96±0.28和0.85±0.23，与相同时间点对照组比较均明显降低（P<0.05），但三种 AD模型之间无明显差异。此外，在给药后不同时间点（2周和4周），各AD模型组Cho/Cr+Cr1与本组给药前相比均明显减小（P<0.05）；同时，Aβ1-40组Cho/Cr+Cr1在给药后4周明显低于给药后2周（P<0.05），但ApoE4组和联合给药组大鼠Cho/Cr+Cr1在给药后2周与4周相比均无明显差异。（4）三种AD模型海马NAA/Cho的改变特点不同。给药后2周，联合给药组大鼠海马NAA/Cho为0.38±0.21，明显低于对照组的0.91±0.08（P<0.05），但 Aβ1-40组和 ApoE4组的NAA/Cho分别为0.81±0.34和1.02±0.33，与对照组无明显差异。给药后4周，Aβ1-40组和联合给药组NAA/Cho分别为0.58±0.21和0.24±0.14，与对照组的0.94±0.07相比均明显降低，且以联合给药组降低更为明显（P<0.05）。同时，在给药后2周，联合给药组大鼠海马NAA/Cho与给药前的0.91±0.21相比明显降低（P<0.05），且降低程度与给药后4周无统计学差异。但Aβ1-40组NAA/Cho在给药后4周才明显低于对照组，ApoE4组则始终与给药前无明显差异。
　　第二次磁共振实验后，进行 Morris水迷宫行为学实验，发现：（1）侧脑室单独注射Aβ1-40或apoE4均明显损伤大鼠空间学习记忆能力，但二者对大鼠空间学习记忆能力损伤的程度无明显差别。在定位航行实验训练的第1天，侧脑室注射Aβ1-40或apoE4与对照组相比，其空间学习能力无明显差异。但在第2-5天，Aβ1-40组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离分别为35.7±1.8 s和832.4±55.4 cm、29.4±1.6 s和554.3±54.9 cm、23.8±1.4 s和459.0±39.0 cm、23.1±1.3 s和405.1±45.7 cm；ApoE4组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离分别为35.1±2.0 s和826.3±70.4 cm、28.6±2.1 s和557.3±53.7 cm、24.0±2.7 s和456.1±33.5 cm、23.4±1.9 s和404.6±45.8 cm。两种AD模型的平均逃避潜伏期和平均游泳距离与对照组第2-5天的26.4±3.8 s和609.0±67.1 cm、21.3±3.5 s和360.2±37.4 cm、16.1±2.8 s和267.4±32.3 cm、14.8±2.5 s和260.3±34.2 cm相比，均明显延长（P<0.05）。在空间探索实验中，Aβ1-40组和ApoE4组大鼠在目标象限游泳的时间和距离占总游泳时间和距离的百分比分别为34.6±1.9％和34.1±2.4%、34.4±1.6%和34.0±2.2%，均明显低于对照组的46.3±3.8%和46.1±3.5%（P<0.01）。同时，在定位航行和空间探索实验中，两种AD模型的空间学习记忆能力损伤均无明显差异。（2）侧脑室联合注射Aβ1-40和apoE4明显损伤大鼠的空间学习记忆能力，且其作用强于单独给予Aβ1-40或apoE4。在定位航行实验第1天，联合给药组与对照组以及单独给予Aβ1-40或apoE4组相比，均无明显差异。第2天，联合给药组大鼠搜索水下平台的平均逃避潜伏期和游泳距离分别为41.1±2.5 s和905.4±80.8 cm，与对照组相比明显延长（P<0.05），但与单独给予Aβ1-40或apoE4组相比无明显差异。在第3-5天，联合给药组大鼠的空间学习能力与单独注射Aβ1-40或apoE4组相比也有明显损伤，其搜索水下平台的平均逃避潜伏期和游泳距离分别为36.0±1.1 s和782.1±71.7 cm、30.7±1.8 s和621.7±39.3 cm、29.8±1.7 s和588.8±34.1 cm。在空间探索实验中，联合给药组大鼠在目标象限游泳的时间和距离占总游泳时间和距离的百分比为27.3±1.8%和26.7±1.3%，不仅明显低于对照组（P<0.01），也明显低于单独给予Aβ1-40或apoE4组（P<0.01）。（3）所有药物均未影响大鼠的视力和运动能力。在连续5天的空间学习训练过程中，各组大鼠的平均游泳速度和寻找可视平台的逃避潜伏期均无明显差异。对照组、Aβ1-40组、ApoE4组和联合给药组的平均游泳速度分别为19.2±1.6 cm/s、19.2±1.7 cm/s、19.4±1.9 cm/s和119.2±1.8 cm/s；到达可视平台的平均时间分别为12.6±0.9 s、112.3±0.8 s、12.7±0.8 s和12.3±0.9 s。
　　Morris水迷宫实验结束后，对大鼠海马的在体场电位进行记录，结果表明：（1）侧脑室单独注射Aβ1-40或apoE4均明显损伤海马CA1区LTP，但二者对LTP的压抑作用无统计学差异。在给予高频刺激（high frequency stimulation, HFS）前，各组的基础fEPSPs幅度始终较稳定，基础突触传递未被影响。当给予HFS后，对照组fEPSPs的幅值立即明显上升到177.8±4.9%，并在HFS后60分钟仍保持在149.3±4.1%。在Aβ1-40组，给予HFS后0分钟、30分钟和60分钟，fEPSPs的幅值分别为147.9±5.8%、123.4±4.1%和117.7±3.8%，与对照组相比，均显示出明显的压抑（P<0.01）；在ApoE4组，给予HFS后0分钟、30分钟和60分钟，fEPSPs的幅值分别为144.4±6.1%、122.8±4.4%和122.4±3.3%，与对照组相比同样被明显压抑（P<0.01）；但在HFS后不同时间点，两种AD模型对LTP的压抑程度无显著差异。（2）侧脑室联合注射Aβ1-40和apoE4明显损伤海马LTP，且其作用强于单独注射Aβ1-40或apoE4。联合给药并未损伤基础突触传递，但在给予HFS后0分钟、30分钟和60分钟，fEPSPs幅值分别为146.5±4.1%、113.6±3.2%和105.0±3.8%，在各时间点与对照组相比均有明显压抑（P<0.01）。同时，在HFS后0分钟和30分钟，联合给药组大鼠fEPSPs的幅值与Aβ1-40组或ApoE4组相比无明显差异；但在HFS后60分钟，联合给药组LTP的压抑程度明显大于单独应用Aβ1-40（P<0.05）或apoE4（P<0.01）组。（3）三种AD模型海马双脉冲易化均未受到影响。在对照组、Aβ1-40组、ApoE4组及联合给药组，海马CA1区的PPF值分别为194.5±6.1%、196.8±7.5%、193.1±6.8%和194.9±5.4%，各组的PPF值无统计学差异（P>0.05）。
　　第三次磁共振检查结束后，进行HE染色、免疫组织化学和western blot检测，结果表明：（1）三种AD模型大鼠均出现明显海马和皮层病理改变，但程度不同。在对照组，海马 CA1区多层神经元整齐排列，神经元边界清楚，细胞核形态正常。在ApoE4组，仅出现海马CA1区神经元排列轻度紊乱，部分细胞间隙略增大。在Aβ1-40组和联合给药组，均可见海马CA1区神经元排列紊乱，神经元数目和层数明显减少，细胞形态不规则、大小不一，细胞间隙明显增大，但在联合给药组大鼠的海马病变更为明显。同时，在三种AD模型大鼠的皮层均有淋巴细胞和小胶质细胞增多，以联合给药组病变更为明显；Aβ1-40组和联合给药组还可见有软化灶出现，（2）三种 AD模型海马和皮层出现不同程度的Aβ免疫阳性细胞。对照组未见明确Aβ阳性细胞；ApoE4组可见散在阳性细胞；Aβ1-40组及联合给药组可见大量的阳性细胞，但联合给药组的阳性细胞数最多。（3）不同 AD大鼠模型表现出不同程度的 pTau（S396）增加。Aβ1-40组和 ApoE4组 pTau(S396)/Tau的值分别为0.969±0.038和1.048±0.041，与对照组的0.606±0.047相比均明显升高（P<0.01），但两种AD模型组之间无明显差异（P>0.05）。在联合给药组大鼠，pTau(S396)/Tau值为1.275±0.051，不仅明显高于对照组（P<0.01），而且也明显高于单独给予Aβ1-40或apoE4组（P<0.01）。
　　结论：
　　（1）在给药后2周，三种AD大鼠模型组与对照组海马T2值无明显差异，提示T2值不是诊断早期AD的可靠方法。在给药后4周，三种AD大鼠模型海马T2值均增高，但联合给药组T2值增高更加明显，推断T2值增高可能提示AD的存在，而且与AD的严重程度相关。（2）在给药后不同时间点，三种AD大鼠模型与对照组海马NAA/Cr+Cr1相比均存在显著性差异，提示NAA浓度在AD早期就发生变化，且与AD的严重程度相关。（3）三种AD模型均可明显损伤大鼠的空间学习记忆能力，但损伤程度有差异，联合给药组的损伤较单独给予Aβ1-40或apoE4组更为严重。结合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在AD早期就发生变化，且不同AD模型NAA浓度减低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1减低可能比行为学实验更敏感。（4）三种AD模型的LTP均受到明显压抑，但以联合给药组LTP的损伤更为严重。结合1H-MRS，NAA/Cr+Cr1在给药后2周就发生变化，给药后4周持续性减低，且三种AD大鼠模型之间NAA浓度减低程度不同，提示NAA/Cr+Cr1对于AD诊断具有较高的敏感性。（5）三种AD模型组均出现包括Aβ沉积和tau蛋白磷酸化在内的典型AD样病理改变，但以联合给药组病理改变较单独给予Aβ1-40或apoE4组更为严重。三种AD模型所出现的病理改变严重程度与在磁共振检查、行为学和电生理实验中所观察到的指标改变和损伤严重程度相一致。

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中文摘要

英文摘要

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 不同AD大鼠模型海马T2值及MRS的初步研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 不同AD模型对大鼠空间学习记忆能力伤害的研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三部分 不同AD模型对大鼠海马LTP的压抑作用研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第四部分 不同AD大鼠模型的形态和分子生物学改变研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

全文结论

参考文献

综述:阿尔茨海默病大鼠模型的MRI研究进展

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历