三涎酸神经节苷脂1b对A型肉毒毒素重链促Neuro-2a细胞突起生长的干预作用

摘要

目的： 确定 Neuro-2a细胞株是否可用于 A型肉毒毒素重链(botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain，BoNT/A HC)体外实验的研究； 观察不同浓度的BoNT/A HC作用后对Neuro-2a细胞神经突起生长的影响，并探讨其机制； 外源性增强或抑制三涎酸神经节苷脂(Trisialoganglioside1b，GT1b)对BoNT/A HC促Neuro-2a细胞神经突起生长作用的影响。 方法： 1.采用激光共聚焦显微镜观察Neuro-2a细胞膜上突触囊泡蛋白2(Synaptic vesicle2，SV2)和三涎酸神经节苷脂1b(Trisialoganglioside1b，GT1b)的表达情况：体外培养Neuro-2a细胞一定时间后取出细胞培养板，进行固定、透膜、封闭、一抗、荧光二抗孵育等处理后置于Olympus激光共聚焦显微镜下观察。 2.观察BoNT/A HC作用后Neuro-2a细胞突起生长情况：细胞接种一定时间(4h)后加入不同浓度的BoNT/A HC，并设对照组(只加入等体积的DMEM基础培养液)，加入BoNT/A HC不同时间后，在相差显微镜下观察Neuro-2a细胞突起生长情况并进行摄像；对图片上的细胞进行神经突起长度的测定、计数细胞突起总数以及有突起的细胞占图片细胞总数的百分比(%)。 3.采用In Cell Western以及常规Western Blot的方法检测BoNT/A HC作用不同时间点细胞内再生相关信号蛋白磷酸化状态的变化。选用的再生信号蛋白为Akt/PKB、ERK1/2：(1)In Cell Western法：对不同时间点不同处理组的细胞进行固定、透膜、封闭、加入相应一抗、红外染料标记二抗，用LI-COR Odyssey双色红外激光成像系统进行检测。此法具有灵敏度高、既可检测蛋白的功能状态，同时又可确定目的蛋白的细胞定位的优点；(2)常规Western Blot的方法：细胞经RIPA缓冲液裂解、提取全浆蛋白、蛋白浓度测定、电泳、转膜、一抗和HRP标记二抗孵育、显色及曝光，随之检测蛋白表达情况。 4.外源性加入GT1b或TVL(Triticum vulgaris Lectin,麦胚凝集素)以增加或抑制Neuro-2a细胞膜上GT1b的含量或功能，观察其对BoNT/A HC促进Neuro-2a细胞突起生长的干预作用：细胞接种后即在培养液内加入一定浓度的GT1b或TVL，以增强或者抑制Neuro-2a细胞膜上GT1b的含量或功能；于细胞接种4h后加入0.1nmol/L的BoNT/A HC，在不同时间点将细胞置于相差显微镜下观察其突起生长状况，并提取全浆蛋白检测再生相关蛋白的磷酸化情况。 结果： 1. Neuro-2a细胞膜上存在与BoNT/A HC结合的高亲和力受体(SV2)以及低亲和力受体(GT1b)的表达，表明Neuro-2a细胞可用于BoNT/A HC相关体外实验。 2.将不同浓度的BoNT/A HC加入细胞培养液内，观察其对细胞突起生长的影响发现：BoNT/A HC作用后细胞突起长度增加、细胞突起数量增多以及有突起细胞占细胞总数的百分比增加，同时观察到随BoNT/A HC浓度的增加其促进突起生长的作用也增强，但当浓度增大到10nmol/L时细胞突起生长出现抑制现象。 3. In Cell Western以及常规Western Blot的方法检测细胞内再生相关蛋白磷酸化变化的结果显示：加入0.1nmol/L的BoNT/A HC后。Akt和ERK1/2的磷酸化均增高，表现为相同浓度(0.1nmol/L)的BoNT/A HC作用后phospho-Akt在1h时表达最强，而phospho-ERK1/2在2h时达高峰，对相同时间不同浓度的BoNT/A HC作用效果观察可以发现0.1nmol/L的 BoNT/A HC处理后与其他浓度组相比 phospho-Akt和phospho-ERK1/2的表达都最强。 4.培养液内外源性加入GT1b使得细胞膜上的GT1b含量增多，在此基础上再给予一定浓度(0.1nmol/L)的BoNT/A HC作用于 Neuro-2a细胞时发现增加细胞膜上GT1b后增强了BoNT/A HC促Neuro-2a细胞突起生长作用，突起的长度、突起数量以及有突起的细胞占细胞总数的百分比较单纯BoNT/A HC组增加；除此外，In Cell Western和常规Western Blot的检测结果也显示增加细胞膜上GT1b的含量后使得phospho-Akt和phospho-ERK1/2的峰值提前至作用后的30min和90min；培养液内加入TVL结合细胞膜上GT1b后再加入BoNT/A HC(0.1nmol/L)发现：消耗细胞膜上GT1b后BoNT/A HC的促再生作用减弱甚至消失，In Cell Western和常规Western Blot的检测结果还表明：用TVL耗竭细胞膜上的GT1b后phospho-Akt和phospho-ERK1/2的变化与对照组相比无明显差异，且也未显示时间效应变化。 结论： Neuro-2a细胞株具备BoNT/A HC入胞的物质基础，含有与BoNT/A HC结合的高亲和力受体(SV2)和低亲和力受体(GT1b)的表达，可作为体外细胞模型用于BoNT/A HC作用效果的观察； BoNT/A HC对Neuro-2a细胞突起生长具有促进作用，但过高浓度的BoNT/A HC则作用减弱。增加细胞膜上GT1b的浓度可以增强BoNT/A HC促细胞突起生长作用；相反用TVL耗竭细胞膜上的GT1b后BoNT/A HC的促突起生长作用减弱或消失。 BoNT/AHC促Neuro-2a细胞神经突起生长的机制极有可能是因BoNT/A HC入胞后激活了细胞内与再生相关的PI3K/Akt以及MAPK/ERK信号通路而实现。